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牛种布鲁氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的构建及免疫效果的初步研究

作　者: 桂丹
导　师: 陈创夫; 乔军
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 布鲁氏菌 wbkA基因 pmm基因同源重组免疫保护性鉴别诊断
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的一类人兽共患的慢性传染病，目前在我国以及世界上大多数国家有比较广泛的流行。该病原菌可感染多种家畜及人，还可感染野生动物，近来还发现该病菌还可感染海洋动物。人类感染布鲁氏菌用抗生素治疗需要持续几个月但不是完全有效，对人类而言没有有效的疫苗，有几个许可的活疫苗可以在牲畜上使用，而这些动物疫苗的效果取决于宿主的种类、免疫剂量、免疫途径。目前世界各国对布病的防控都主要采用的是疫苗接种，然而又因现用疫苗都普遍存在毒力较强，可引起怀孕母畜的流产，甚至还可感染人等缺陷，同时使用了疫苗后难以区分自然感染和疫苗免疫，从而限制了疫苗的实际应用。因此，本研究拟通过缺失牛种布鲁氏菌2308的wbkA，pmm基因构建相应的缺失株，初步评价其毒力和免疫保护效果。同时表达了WBKA，PMM两个蛋白，开发出一种能有效区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌弱毒基因缺失株，旨在筛选具有潜在应用价值的疫苗候选株。本文所做的主要工作及成果如下：1.布鲁氏菌2308株wbkA和pmm基因缺失株的构建及鉴定：以牛种布鲁氏菌2308为模板高保真扩增wbkA和pmm基因上下游同源臂，以枯草芽孢杆菌为模板高保真扩增SacB基因，将得到的上下臂SacB与分别连接到pGEM-7zf+，构建pGEM-7zf-wbkA-SacB（pwS）和pGEM-7zf-pmm-SacB（ppS）。自杀载体pGEM-7Zf+上，分别构建成pGEM-7Zf+-ΔwbkA和pGEM-7zf+-Δpmm，制备牛种布鲁氏菌2308感受态，电转化重组质粒pwS和ppS，通过氨苄、蔗糖的两次筛选得获得ΔwbkA和Δpmm基因缺失株，进行遗传稳定性检测。2.ΔwbkA和Δpmm基因缺失株的毒力及免疫效果的初步评价：在小鼠巨噬细胞RAW264.7水平初步验证ΔwbkA和Δpmm的毒力；用缺失株免疫6周龄昆明白小鼠，通过CFU计数初步评价缺失株的毒力；通过常规血清学试验初步验证小鼠体内的抗体水平，采用间接ELISA方法检测小鼠体内总IgG水平以及细胞因子IFN-γ的水平；对用缺失株免疫30d后的小鼠进行攻毒试验评价其保护效果。3.构建原核表达载体pET-wbkA和pET-pmm及鉴别诊断：用PCR方法分别扩增wbkA和pmm基因，将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a上，然后转化至大肠杆菌DE3（BL21）中诱导表达并纯化WBKA和PMM蛋白，再以纯化的WBKA和PMM蛋白作为抗原，与缺失株ΔwbkA和Δpmm免疫的小鼠血清进行Westernblot分析，鉴定血清中是否存在抗WBKA和PMM的抗体。本研究结果表明ΔwbkA和Δpmm缺失株具有一定的遗传稳定性，ΔwbkA和Δpmm缺失株的毒力较亲本株2308相比有一定程度的下降，且毒力与疫苗株S19差异不大。免疫原性试验结果显示同时ΔwbkA和Δpmm缺失株均能诱导机体产生一定的抗体。攻毒试验结果表明缺失株能保护小鼠免受2308强毒株的感染，保护力与疫苗株S19相比略低。WB结果显示ΔwbkA缺失株和Δpmm缺失株免疫的小鼠的血清中不能产生抗WBKA蛋白和PMM蛋白的抗体。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
英文及字符缩略词表  12-13
引言  13-14
第一章文献综述  14-26
  1 布鲁氏菌病的概述  14-16
    1.1 布鲁氏菌病的病原  14
    1.2 布鲁氏菌病的概况  14-15
    1.3 布鲁氏菌病的危害  15
    1.4 布鲁氏菌病的防控  15
    1.5 布鲁氏菌病疫苗的应用  15-16
  2 布鲁氏菌疫苗的概述  16-22
    2.1 弱毒活疫苗  16-18
    2.2 灭活疫苗  18
    2.3 重组蛋白苗  18-19
    2.4 基因突变株疫苗  19-22
  3 布鲁氏菌的毒力因子  22-24
    3.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）  22-23
    3.2 脂多糖（LPS）生物合成相关的毒力基因  23
    3.3 外膜蛋白（OMPs）  23-24
    3.4 四型分泌系统（VirB）  24
    3.5 双组份调控系统（BvrR/BvrS）  24
  4 展望  24-26
第二章试验研究  26-61
  实验一牛种布鲁氏菌株2308株wbkA、pmm基因缺失株的构建  26-39
    摘要  26
    1 材料与方法  26-32
      1.1 材料  26-27
      1.2 方法  27-32
    2 结果  32-37
      2.1 布鲁氏菌ΔwbkA缺失株的构建  32-35
      2.2 布鲁氏菌Δpmm基因缺失株的构建  35-36
      2.3 缺失株ΔwbkA和Δpmm的遗传稳定性检测  36-37
    3 讨论  37-38
    4 结论  38-39
  实验二牛种布鲁氏菌2308ΔwbkA和Δpmm缺失株的毒力及免疫效果的初步评价  39-50
    摘要  39
    1 材料与方法  39-43
      1.1 材料  39-40
      1.2 实验方法  40-41
      1.3 缺失株的免疫效果评价  41-43
    2 结果  43-47
      2.1 侵染小鼠巨噬细胞CFU结果  43-44
      2.2 小鼠脾脏形态观察  44
      2.3 小鼠脾脏细菌计数测定缺失株毒力  44-45
      2.4 体液免疫  45-46
      2.5 细胞免疫  46-47
      2.6 攻毒保护力的评价  47
    3 讨论  47-49
      3.1 缺失株毒力评价  48
      3.2 体液免疫水平分析  48
      3.3 细胞免疫水平分析  48-49
      3.4 保护力评价  49
    4 结论  49-50
  实验三布鲁氏菌wbkA和pmm基因的原核表达及鉴别诊断  50-61
    摘要  50
    1 材料与方法  50-55
      1.1 材料  50-51
      1.2 方法  51-55
    2 结果  55-60
      2.1 目的基因的扩增  55-56
      2.2 重组表达质粒的构建及鉴定  56
      2.3 WBKA和PMM蛋白的表达  56-58
      2.4 WBKA和PMM蛋白的纯化  58
      2.5 Westernblot验证蛋白的反应原性  58
      2.6 血清学检测结果  58-59
      2.7 Westernblot鉴定  59-60
    3 讨论  60
    4 结论  60-61
参考文献  61-69
实验结论  69-70
致谢  70-71
作者简介  71

牛种布鲁氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的构建及免疫效果的初步研究

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