学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和NS3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

作 者: 聂明非
导 师: 王君伟
学 校: 东北农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 牛病毒性腹泻病毒 E2 单克隆抗体 鉴别诊断 NS3
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 79次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea,BVD),是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种疾病,症状主要表现为腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染,免疫抑制与免疫耐受,母畜流产、畸胎和死胎等。BVDV宿主较为广泛,可以感染牛、猪、羊、骆驼和其他多种野生动物。该病在全世界广泛分布,由于该病毒能引起繁殖系统病变并形成持续性感染,因而对养牛业造成了重要的影响。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属成员,与其同属的有猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(DBV)及部分未分类瘟病毒。BVDV基因组含有一个大的开放阅读框架(ORF)和两侧的非翻译区(UTR),编码10~11种蛋白。E2是BVDV的结构蛋白之一,是免疫原性最强、变异性最强的糖蛋白,在靠近N末端的一半含有多种依赖构象的抗原结构区,其N端伸出BVDV囊膜表面,是决定BVDV抗原性的主要部位,也是与BVDV抗体结合、介导中和反应及宿主细胞识别、吸附的主要部位,E2蛋白上存在区分瘟病毒的抗原决定簇。BVDV和CSFV具有很高的同源性和非常相似的感染谱,给疾病的鉴别诊断带来了一定的困难。因此,本试验利用BVDV E2的重组真核表达质粒pcDNA3.1-E2免疫BALB/c小鼠,用纯化的BVDV全病毒作为阳性杂交瘤细胞的筛选抗原,经4次克隆制备了3株单克隆抗体,命名为2E2、3D12、4D6。2E2和4D6株抗体为IgM类,3D12为IgG2a亚类,轻链均为κ链。通过Western blot和间接免疫荧光检测发现:3株单抗均针对E2的构象表位,其中2E2和4D6株单抗针对的表位不是BVDV和CSFV所共有,所制备的3株单抗为鉴别诊断方法的建立提供了物质基础。NS3是BVDV的一种非结构蛋白,主要负责病毒多聚蛋白的翻译后加工,产生成熟的病毒蛋白,是病毒自我复制的前提条件。NS3在瘟病毒属中非常保守,是一种免疫优势蛋白,在自然感染或弱毒疫苗免疫后的动物体内均可检出针对该蛋白的抗体。目前国内还未见BVDV-NS3单抗的报道。本试验利用实验室原核表达的NS3全长蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体,命名为1C8、2H4、4B5、4F6、4F8。1C8,4F8为IgG2b亚类;2H4为IgG1亚类;4B5,4F6为IgG2a亚类,轻链均为κ链。5株单抗效价均较高,通过Western blot鉴定,5株单抗均能与重组NS3蛋白特异性结合。所制备的5株单抗为BVD检测方法的建立及NS3蛋白的研究提供了物质材料。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-23
  1.1 BVDV 的生物学特性  11-12
    1.1.1 BVDV 的分类地位  11
    1.1.2 BVDV 的形态特征  11-12
    1.1.3 BVDV 的生物多样性  12
  1.2 BVDV 的基因组结构  12-13
    1.2.1 BVDV 的5'-UTR 和3'-UTR  12-13
    1.2.2 BVDV 的ORF  13
  1.3 BVDV 结构蛋白的研究进展  13-15
  1.4 BVDV 非结构蛋白的研究进展  15-17
  1.5 牛病毒性腹泻-黏膜病的临床类型  17-18
    1.5.1 持续性感染  17
    1.5.2 黏膜病  17
    1.5.3 急性BVD  17-18
    1.5.4 繁殖障碍  18
    1.5.5 血小板减少和出血性综合征  18
  1.6 BVD 病原学诊断方法的进展  18-20
    1.6.1 病毒分离  18-19
    1.6.2 电镜检查  19
    1.6.3 免疫过氧化物酶(IP)技术  19
    1.6.4 酶联免疫吸附试验检测抗原  19
    1.6.5 反转录-多聚酶链式反应(RT–PCR)  19-20
    1.6.6 核酸杂交试验(NAH)技术  20
  1.7 牛病毒性腹泻病血清学检测方法进展  20-21
    1.7.1 病毒中和试验  20
    1.7.2 酶联免疫吸附试验检测抗体  20-21
  1.8 BVDV 单克隆抗体的研究及应用  21-22
  1.9 研究的目的与意义  22-23
2 材料与方法  23-33
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 病毒、质粒、菌株  23
    2.1.2 实验动物与细胞  23
    2.1.3 血清  23
    2.1.4 主要试剂  23
    2.1.5 主要仪器和设备  23-24
    2.1.6 主要溶液配制  24-25
  2.2 方法  25-33
    2.2.1 免疫原和筛选抗原的制备  25-28
    2.2.2 动物免疫  28
    2.2.3 单克隆抗体检测方法的建立  28-29
    2.2.4 单克隆抗体的制备  29-30
    2.2.5 杂交瘤细胞鉴定  30-31
    2.2.6 单克隆抗体的鉴定  31-33
3 结果  33-43
  3.1 重组质粒pcDNA3.1-E2 酶切鉴定结果  33
  3.2 大量提取的质粒pcDNA3.1-E2 的浓度及纯度  33-34
  3.3 重组 BVDV-NS3 蛋白的 SDS-PAGE 分析  34-35
  3.4 杂交瘤细胞间接ELISA 筛选方法的建立  35-36
  3.5 阳性杂交瘤细胞的筛选结果  36
  3.6 杂交瘤细胞株的鉴定  36-39
    3.6.1 杂交瘤细胞染色体数分析  36-38
    3.6.2 杂交瘤细胞稳定性分析  38-39
  3.7 单克隆抗体的鉴定  39-43
    3.7.1 单克隆抗体Ig 类型的鉴定  39-40
    3.7.2 杂交瘤细胞上清Western blot 鉴定  40-41
    3.7.3 E2 杂交瘤细胞上清与 BVDV 和 CSFV 的 IFA 鉴定  41-42
    3.7.4 E2 单克隆抗体中和活性测定  42-43
4 讨论  43-45
  4.1 E2 单克隆抗体的制备及鉴定  43-44
    4.1.1 免疫原和检测抗原的选择  43
    4.1.2 单克隆抗体Western blot 分析  43
    4.1.3 E2 单克隆抗体与BVDV 和CSFV 的间接免疫荧光鉴定  43-44
  4.2 NS3 单克隆抗体的应用前景  44-45
5 结论  45-46
致谢  46-47
参考文献  47-53
攻读硕士学位期间发表的学术论文  53

相似论文

  1. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  2. 下肢神经查体在L4-5及L5-S1LDH鉴别诊断中的意义,R681.53
  3. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  4. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  5. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  6. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  7. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  8. 抗噻菌灵单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立,S482.2
  9. 氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究,S482.3
  10. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  11. 猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究,S858.28
  12. H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立,S855.3
  13. 日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定,R392
  14. 阿斯匹林、姜黄素对人HT-29、SW480细胞中β-catenin、COX-2及PGE2的影响,R735.35
  15. 三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立,S859.84
  16. 雌激素介导ERα调控子宫内膜间质细胞β-catenin表达的分子机制及在子宫内膜异位症形成和发展中的意义,R711.71
  17. 阿司匹林诱生型脂氧素抑制脂多糖诱发的星形胶质细胞炎症反应,R965
  18. 17α雌二醇对APP/PS1 N2a基因转染细胞Aβ生成的影响及其机制的研究,R739.4
  19. AGR2单克隆抗体18A4抑制乳腺癌细胞的生长和迁移,R737.9
  20. 病毒性脑膜脑炎的鉴别诊断评价模型,R512.3
  21. 氟对大鼠成骨细胞Nrf2-ARE信号转导通路的作用研究,R599

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com