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副鸡禽杆菌体内诱导基因的筛选研究

作　者: 梁玉荣
导　师: 王雪敏; 王宏俊
学　校: 河北工程大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 副鸡禽杆菌体内诱导抗原技术(IVIAT) 基因文库的构建基因文库的筛选 H18L基因缺失
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 13次
引　用: 1次
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内容摘要

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)是鸡传染性鼻炎的致病菌,主要引起鸡的生长发育受阻,产蛋量下降,给养鸡业带了相当大的经济损失。病原菌体内诱导基因的研究是探索该病防治措施的重要基础。副鸡禽杆菌侵入宿主后,为了适应体内的环境,会启动一系列基因的表达,这些体内诱导基因有可能是引起疾病的关键基因,有可能作为候选的免疫及药物分子新靶位。本研究首先提取Apg基因组DNA,用Sau3A I酶切后回收片段插入到pET系统表达载体中,构建副鸡禽杆菌的全基因组表达文库。应用体内诱导抗原技术(In vivo induced antigen technology, IVIAT)的原理,先用IPTG诱导文库表达蛋白,然后用经体外培养的副鸡禽杆菌菌株和大肠杆菌BL21(DE3)吸附过的鸡副鸡禽杆菌血清对该文库进行初筛和复筛,对筛选得到的阳性克隆提取质粒用T7启动子引物测序,测得的序列在NCBI上比对后确定开放阅读框(ORF)。以筛选获得的H18膜合成域2基因簇为研究对象构建基因缺失载体,然后将H18基因缺失载体电转入副鸡禽杆菌,用卡那霉素和蔗糖进行筛选,用PCR初步鉴定H18L基因缺失的菌株。本实验构建了副鸡禽杆菌基因组表达文库,文库大小为6×103,文库重组质粒含有率大于80%,达到了理论要求。经过筛选、测序和比对本实验最终确定了5个开放阅读框。有一个表达为转运谷氨酰还原酶,一个转录终止因子和荚膜合成域2基因簇,还有两个表达为保守假想蛋白。在此基础上,成功构建了副鸡禽杆菌H18L基因的缺失载体,并将该载体电转入到副鸡禽杆菌0083标准菌株中,目前正在进行鉴定工作。本研究应用体内诱导抗原技术筛选到了5个副鸡禽杆菌在宿主体内诱导表达的基因,并对基因的功能进行了初步探讨,在研究副鸡禽杆菌在宿主体内生存和致病关键基因奠定了基础,也为鸡传染性鼻炎防治研究提供了思路。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
缩略词(Abbrev i at i on)  12-13
第1章文献综述  13-25
  1.1 副鸡禽杆菌的研究进展  13-20
    1.1.1 副鸡禽杆菌的简介  13
    1.1.2 病原学  13-18
    1.1.3 流行病学及发病机理  18-19
    1.1.4 疫苗防治  19-20
  1.2 体内诱导抗原技术(IVIAT)的原理与应用进展  20-23
    1.2.1 体内诱导抗原技术(IVIAT)的基本原理  21
    1.2.2 清探针的制备  21
    1.2.3 基因组表达文库的构建  21
    1.2.4 表达文库的筛选  21
    1.2.5 IVIAT的应用  21-22
    1.2.6 IVIAT的优点和不足  22-23
  1.3 突变株构建方法的研究进展  23-25
    1.3.1 转座子突变技术  23-24
    1.3.2 点突变技术  24
    1.3.3 同源重组技术  24-25
第2章研究目的和意义  25-26
第3章基因文库的构建与体内诱导抗原的筛选  26-52
  3.1 材料  26-30
    3.1.1 实验材料  26
    3.1.2 主要试剂和材料  26
    3.1.3 主要溶液  26-30
  3.2 引物合成  30
  3.3 实验仪器设备  30
  3.4 方法  30-41
    3.4.1 血清探针的制备  30-31
    3.4.2 副鸡禽杆菌基因组表达文库的构建  31-36
    3.4.3 重组质粒的鉴定  36-37
    3.4.4 重组质粒的转化  37
    3.4.5 表达文库的筛选  37-39
    3.4.6 阳性克隆的鉴定  39
    3.4.7 H18基因的克隆与表达  39-41
  3.5 结果与分析  41-49
    3.5.1 副鸡禽杆菌基因组的PCR鉴定  41
    3.5.2 副鸡禽杆菌基因组DNA片段回收  41-42
    3.5.3 表达载体的制备  42-43
    3.5.4 重组质粒的鉴定  43-44
    3.5.5 副鸡禽杆菌基因组表达文库大小计数  44
    3.5.6 基因文库的筛选与鉴定  44-45
    3.5.7 阳性克隆重组质粒的测序及分析  45-47
    3.5.8 H18L基因片段的PCR扩增  47
    3.5.9 重组质粒的构建  47-48
    3.5.10 荚膜蛋白的SDS-PAGE与Western-Blot检测  48-49
  3.6 讨论  49-52
    3.6.1 体内诱导的抗原技术(IVIAT)  49-50
    3.6.2 构建副鸡禽杆菌基因组表达文库  50
    3.6.3 阳性克隆重组质粒的测序及分析  50
    3.6.4 H18L基因的克隆与表达  50-52
第4章副鸡禽杆菌H18L基因缺失株的构建  52-65
  4.1 前言  52
  4.2 验材料和设备  52
  4.3 引物合成  52-53
  4.4 方法  53-59
    4.4.1 基因缺失载体的构建与鉴定  53-57
    4.4.2 供体菌的构建  57-58
    4.4.3 β2155-pEM-ΔH18L供体菌的鉴定  58
    4.4.4 基因缺失载体的电转化  58-59
  4.5 结果与分析  59-64
    4.5.1 引物设计  59-60
    4.5.2 H18L基因片段的PCR扩增  60
    4.5.3 重组T载体的PCR鉴定  60-61
    4.5.4 重组T载体酶切鉴定  61
    4.5.5 目的基因的测序  61
    4.5.6 重组T载体的反向PCR  61-62
    4.5.7 缺失载体PCR鉴定  62
    4.5.8 缺失载体的酶切鉴定  62-63
    4.5.9 自杀质粒pEMOC-2的酶切  63-64
    4.5.10 供体菌的构建  64
  4.6 讨论  64-65
结论  65-66
参考文献  66-72
致谢  72-73
作者简介  73
攻读硕士学位期间发表的论文  73

副鸡禽杆菌体内诱导基因的筛选研究

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