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副猪嗜血杆菌间接ELISA方法的建立及其体内诱导基因的筛选

作　者: 冯小明
导　师: 逯忠新；薛慧文
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防动物医学
关键词: 副猪嗜血杆菌(HPS) 酶联免疫吸附试验(ELISA) 抗体体内诱导抗原技术(IVIAT) 基因组表达文库体内诱导基因
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪上呼吸道的一种常在菌,但却因其被证明是以多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的格拉泽氏病的病原体而广受关注。格拉泽氏病发病率一般在10%～15%,严重时死亡率可达50 %。在近10多年来,该病在保育猪群的发生突然增加,并导致大量猪只死亡,已成为危害养猪业的重要传染病之一。虽然人们愈益重视了对HPS感染的研究,但导致HPS流行的因素目前仍不清楚,至今仍有许多问题不能得到满意的回答。特别是对毒力因子的检测、毒力因子的作用机理、诊断方法的改进和新型广谱疫苗的研发等。本研究采用超声裂解的HPS菌体上清作为包被抗原,通过对各个实验条件的摸索、优化和确定,建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法。用该方法检测猪胸膜肺炎放线杆菌、猪巴氏杆菌、大肠杆菌、猪链球菌抗体均为阴性,表明其特异性良好;对200份临床样品的检测结果表明其敏感性明显高于间接血凝试验;重复性试验表明此方法具有良好的重复性和稳定性。该方法可用于HPS的快速、准确诊断,对于HPS的检疫和流行病学调查具有积极的意义。本研究还应用IVIAT技术对HPS 5型标准株体内表达基因进行了筛选。依次用HPS 5型培养物上清、菌体、菌体裂解上清、BL21（DE3）菌体、BL21（DE3）菌体裂解上清对HPS 5型感染猪血清进行吸附处理,用ELISA方法检测HPS和BL21抗体水平的变化,直至基本去除感染血清中的非体内表达蛋白抗体。建立了库容量为1.0×10⁴的HPS 5型标准株基因组随机表达文库pet30a-HP009-BL21（DE3）Plys,利用吸附处理的HPS感染血清对文库进行免疫印迹筛选,第一轮共筛选到13个阳性克隆,经两轮复筛后得到10个阳性克隆。对阳性克隆进行测序后获得12个ORF,经BLAST比对和功能聚类分析表明,6个ORF编码新陈代谢及生物合成相关蛋白,分别是5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸盐-高半胱氨酸-S-甲基转移酶、DNA结合蛋白、UV特异的切割酶、硝酸盐还原酶、脱氧尿苷三磷酸酶、DNA聚合酶β;4个ORF编码转运蛋白,分别为转铁蛋白、Mg²⁺、Co²⁺平衡转运系统、三聚自身转运载体、酰胺磷酸核糖基转移酶;1个ORF编码信号转导蛋白—丝氨酸蛋白酶;1个ORF编码调控蛋白—麦芽糖代谢调节器。分别对12个ORF进行RT-PCR验证,结果显示5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸盐-高半胱氨酸-S-甲基转移酶和毒力相关三聚自身转运载体为HPS 5型体内表达基因。这些体内表达基因的发现为我们进一步研究HPS的致病机理奠定了一定的基础,有可能在HPS疫苗、检测诊断和抗菌药物的开发等方面起到重要的作用。

全文目录

摘要  2-3
Summary  3-7
缩略词(Abbreviation)  7-8
第一章文献综述  8-17
  1 副猪嗜血杆菌的研究进展  8-13
    1.1 HPS 的病原学研究  8
    1.2 HPS 流行病学研究  8
    1.3 HPS 的诊断方法研究进展  8-10
    1.4 致病性与毒力研究  10-12
    1.5 防治  12-13
  2 细菌毒力基因的筛选方法及体内诱导抗原技术（IVIAT）的研究  13-16
    2.1 细菌毒力基因的筛选方法  13
    2.2 IVIAT 技术的基本原理  13-14
    2.3 IVIAT 技术的应用进展  14-15
    2.4 IVIAT 技术的优缺点  15-16
  3 研究的目的和意义  16-17
第二章副猪嗜血杆菌抗体检测间接ELISA 方法的建立  17-24
  1 实验材料  17
    1.1 菌种及血清  17
    1.2 实验试剂  17
    1.3 实验仪器  17
  2 实验方法  17-20
    2.1 HPS 的培养  17
    2.2 抗原的制备  17
    2.3 阴、阳性血清的制备  17-18
    2.4 所需溶液的配制  18
    2.5 间接ELISA 方法的建立  18-20
    2.6 间接ELISA 的特异性试验  20
    2.7 间接ELISA 重复性试验  20
    2.8 间接ELISA 的临床应用  20
  3 结果  20-23
    3.1 间接ELISA 反应条件的选择结果  20-22
    3.2 间接ELISA 特异性试验  22
    3.3 间接ELISA 重复性试验  22-23
    3.4 间接ELISA 样品检测及临床应用  23
  4 讨论  23-24
第三章副猪嗜血杆菌基因表达文库的构建  24-31
  1 材料  24-26
    1.1 主要试剂  24
    1.2 PET-30a 质粒图谱  24
    1.3 溶液及其培养基的配制  24-25
    1.4 主要仪器  25-26
  2 实验方法  26-28
    2.1 副猪嗜血杆菌基因组DNA 的大量制备  26
    2.2 基因组酶切  26
    2.3 基因组DNA 的回收  26
    2.4 用碱裂解法提取质粒  26-27
    2.5 质粒的构建及去磷酸化处理  27-28
    2.6 转化实验  28
    2.7 文库质粒的提取  28
  3 结果与分析  28-30
    3.1 基因组酶切结果  28
    3.2 基因组DNA 的部分酶切和回收  28-29
    3.3 表达文库的构建和质量鉴定  29-30
  4 讨论  30-31
第四章副猪嗜血杆菌体内表达抗原的筛选和基因的分析  31-46
  1 材料  31-32
    1.1 实验材料  31
    1.2 实验仪器  31
    1.3 实验溶液的配制  31-32
  2 实验方法  32-36
    2.1 感染血清的制备  32
    2.2 血清的吸附处理  32-33
    2.3 吸附处理血清的ELISA 检测  33
    2.4 基因组表达文库的筛选  33-34
    2.5 IVI 基因的RT-PCR 验证  34-36
  3 结果与分析  36-41
    3.1 感染猪血清的抗体水平  36
    3.2 检测吸附血清的抗体水平  36
    3.3 HPS 基因组表达文库的筛选  36-37
    3.4 体内诱导抗原基因的测序和功能预测  37-39
    3.5 IVI 基因的RT-PCR 验证结果  39-41
  4 讨论  41-46
第五章结论  46-47
参考文献  47-53
致谢  53-54
作者简历  54-56
附表  56-71

副猪嗜血杆菌间接ELISA方法的建立及其体内诱导基因的筛选

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