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鸡新城疫与传染性支气管炎病毒胶体金联检试纸条的研究

作　者: 都跃
导　师: 肖运才
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒传染性支气管炎病毒胶体金鉴别检测
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

新城疫(Newcastle Disease, ND)又名亚洲鸡瘟,与鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis, IB)同属禽类的高度接触性呼吸道传染病。这两种病毒性疾病主要侵害一些家禽以及野禽,并在世界范围内广泛流行,给全球养禽业带来了巨大的经济损失。新城疫病毒(Newcastle Disease virus, NDV)全基因共编码6种结构蛋白,其中血凝素神经氨酸糖蛋白HN是重要的功能性蛋白,常作为免疫原成分应用于各种研究中；鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus,IBV)全基因编码四种结构蛋白,其中核衣壳蛋白N作为IBV的内部蛋白也同时具有良好的免疫原性。因此,本试验选用NDV的HN和IBV的N作为免疫原制备单克隆抗体,并将其应用于胶体金免疫层析技术中,建立鉴别诊断新城疫和鸡传染性支气管炎的方法,为快速、准确地鉴别诊断这两种鸡的主要呼吸道疾病提供有效的临床检测方法。主要的试验结果如下：1.单克隆抗体的制备与纯化利用NDV-HN基因去信号肽和跨膜区重组质粒(其目的片段大约为1590bp)诱导表达得到大小约为80KDa的蛋白；同时利用IBV-N基因全长重组质粒(其目的片段大约为1230bp)诱导表达得到大小约为80KDa的蛋白。分别应用这两种蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后测定血清效价均达到1：16000,经过融合、克隆,得到4株NDV-McAb,分别命名为：2F2B2、4A10F11、4E2A9、4F4E2,同时得到1株IBV-McAb,命名为2E2A2。分别用ELISA和HI的方法测定这5株单抗的效价结果显示：4株NDV-McAb的ELISA效价为1.6×104-3.2×104,HI的检测效价为29-212；IBV-McAb的ELISA效价为1.6×104,HI的检测效价为27。其中抗NDV单抗具有良好的特异性。IBV-2E2A2单抗仅与AIV-H9有微弱的反应,而与NDV、AIV-H5、 ILTV、IBDV、EDS-76均不发生交叉反应。2.多克隆抗体的制备及纯化将本实验室分离保存的肾型传支-孝感分离株。经SPF鸡胚增殖纯化后,取少量的浓缩液加入1%胰酶,在37℃条件下作用1h,采用HA检测其效价为213。用该病毒浓缩液与弗氏佐剂进行乳化,免疫20日龄无免艾维茵肉鸡,三免后测得血清效价均高于1：8000。加强免疫后第10d,经心脏采血获得阳性血清,采用饱和硫酸铵法粗提,经葡聚糖凝胶层析柱纯化,最终获得浓度为8mg/ml的鸡抗IBV多克隆抗体。以NDV、IBV、AIV-H5、AIV-H9、ILTV、IBDV、EDS-76作为包被原,采用间接ELISA的方法检测其特异性良好。3.快速鉴别检测试纸条的建立本试验采用柠檬酸三钠还原法,制备出的胶体金颗粒均一、稳定,最大吸收峰在523nm处。选用单克隆抗体标记胶体金,首先得到了反应的最适pH值为8。测定其最适标记抗体蛋白量为7.2μg/ml。选取另外一株NDV-McAb和已制备的IBV-多抗,采用0.01mol/LpH7.2PB+3%Methanol+0.1%Sucorse作为包被液分别将其包被于NC膜上,封闭液最终选择为0.1MpH7.4PBS+2.5%蔗糖+2%BSA+0.02%NaN3+0.75%聚乙烯吡咯烷K30(PVPK30)+0.5%Teewn-20+0.5%PEG-2000。对已组装制备的试纸条进行了特异性检测,结果显示试纸条的特异性良好,不与AIV-H5、AIV-H9、ILT、IBDV、EDS-76病毒发生交叉反应。并且分别在NDV-HI标准抗原稀释10000倍,IBV-HI标准抗原稀释640倍的情况下能够检测到条带,说明灵敏度较高,在4℃条件下可至少保存35d。4.临床检测实验动物试验划分4个试验组,第一组为新城疫组,第二组为传支组,第三组为混合组,第四组为对照组。在攻毒后第三天采集喉头和泄殖腔棉拭子,可检测到新城疫病毒,第五天可检测到传支病毒,在攻毒后第10天,宰杀并剖检病鸡,发现传支组只在呼吸道和消化道出现病变,如气管喉头出血,腺胃有出血点等。新城疫组与混合感染组病症相似,除呼吸道和消化道外,也在其它脏器发现有出血点,肿胀,以及腿肌有出血点等症状。分别用间接ELISA和试纸条对所有组别鸡的喉头和泄殖腔棉拭子进行检测,阳性检出符合率为93.3%。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词  10-12
1 文献综述  12-23
  1.1 新城疫病毒概述  12-14
  1.2 传染性支气管炎病毒概述  14-16
  1.3 检测方法研究进展  16-23
    1.3.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验  16-17
    1.3.2 反转录—聚合酶链式反应技术(RT—PCR)  17-18
    1.3.3 核酸探针技术  18
    1.3.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)  18-19
    1.3.5 基因芯片技术  19-20
    1.3.6 胶体金免疫层析技术  20-23
2 研究目的与意义  23-24
3 材料与方法  24-37
  3.1 材料  24-25
    3.1.1 抗原  24
    3.1.2 细胞、血清、鸡胚及实验动物  24
    3.1.3 主要试剂与材料  24-25
    3.1.4 主要试剂的配制  25
    3.1.5 主要仪器  25
  3.2 方法  25-37
    3.2.1 新城疫HN基因重组质粒鉴定及蛋白的表达纯化  25-27
    3.2.2 传染性支气管炎N基因重组质粒鉴定及蛋白的表达纯化  27-28
    3.2.3 单克隆抗体的制备及纯化  28-30
    3.2.4 鸡抗IBV多克隆抗体的制备及纯化  30-31
    3.2.5 试纸条检测方法的建立  31-35
    3.2.6 临床应用试验  35-37
4 结果与分析  37-49
  4.1 基因重组质粒鉴定及蛋白的表达纯化  37-39
    4.1.1 基因重组质粒鉴定  37
    4.1.2 蛋白诱导表达  37-38
    4.1.3 Western Blot检测蛋白的免疫学活性  38-39
  4.2 单克隆抗体的制备与纯化  39-40
    4.2.1 动物免疫  39
    4.2.2 单克隆抗体的获得  39-40
    4.2.3 单克隆抗体效价的测定  40
    4.2.4 单克隆抗体特异性的鉴定  40
    4.2.5 单克隆抗体的冻存与复苏  40
  4.3 多克隆抗体的制备与纯化  40-41
    4.3.1 病毒的增殖与纯化  40
    4.3.2 鸡抗IBV多克隆抗体的制备  40-41
    4.3.3 多克隆抗体的特异性鉴定  41
  4.4 试纸条检测方法的建立  41-47
    4.4.1 胶体金的制备  41
    4.4.2 胶体金标记单克隆抗体蛋白最适pH值的确定  41-43
    4.4.3 胶体金标记单克隆抗体蛋白最适标记量的确定  43
    4.4.4 试纸条的构建  43-44
    4.4.5 试纸条包被条件的优化  44
    4.4.6 试纸条封闭条件的优化  44-45
    4.4.7 试纸条特异性的鉴定  45
    4.4.8 联检试纸条灵敏度的鉴定  45-46
    4.4.9 试纸条保存期的鉴定  46-47
  4.5 临床应用试验  47-49
5 讨论  49-52
  5.1 蛋白的纯化与表达  49-50
  5.2 单克隆抗体的制备  50
  5.3 胶体金的制备  50
  5.4 试纸条检测方法的建立  50-51
  5.5 临床应用试验  51-52
6 结论  52-53
参考文献  53-58
致谢  58

鸡新城疫与传染性支气管炎病毒胶体金联检试纸条的研究

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