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鸡传染性支气管炎病毒H120、W93、H52、M41疫苗株鸡胚肾细胞培养及生物学特性的研究

作　者: 樊晓旭
导　师: 王栋
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡传染性支气管炎病毒鸡胚肾细胞生物学特性荧光定量PCR方法
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨人的经济损失。由于鸡传染性支气管炎病毒的宿主范围窄,较难适应细胞培养,病毒主要使用鸡胚培养制备,而很少使用细胞培养方法。而且,目前对IBV在细胞上培养及其生物学特性方面的研究还比较少,因此,对IBV特别是疫苗株进行这方面的研究是非常必要的。本实验对IBV疫苗株在鸡胚肾(CEK)细胞上进行了培养及生物学特性鉴定,建立了鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR(IBV FQ-PCR)快速检测方法,用于病毒含量的快速检测。首先,将IBV H120、W93、H52和M41疫苗株在鸡胚肾(CEK)细胞、鸡胚成纤维(CEF)细胞、Vero细胞、添加TPCK胰酶培养的Vero细胞和添加D-氨基葡萄糖培养的Vero细胞上进行了传代培养,经RT-PCR检测发现用CEK细胞培养IBV疫苗株生长效果最好。将H120、W93、H52和M41株在CEK细胞上继续培养传代至25代,进行细胞毒致CEK细胞病变和感染鸡胚病变的观察、血凝试验、病毒含量的测定、S1基因序列测定比对分析及血清学试验,研究IBV疫苗株CEK细胞毒的生物学特性。结果表明,IBV疫苗株CEK细胞毒能够引起CEK细胞圆缩、聚团,产生特异性细胞病变；病毒接种鸡胚后,感染鸡胚出现失水、蜷缩、生长发育小等病变；尽管经产气荚膜梭菌上清液处理,但IBV疫苗株细胞毒不表现血凝性；用EID50方法测定的细胞毒病毒含量比鸡胚尿囊液毒低约1个滴度；IBV细胞毒S1基因突变与病毒含量变化有关,少数氨基酸的改变(即点突变)可能引起毒力的改变。此外,在培养过程中发现,M41株在CEK细胞上传代至第3代即出现细胞病变,适应性要比其他3株快；M41 E11P18细胞毒病毒滴度最高,为106.87EID50/0.1mL,M41病毒滴度平均值高于其他3个疫苗株细胞毒；在CEK细胞传代过程中,IBV H120和H52株S1基因变异比W93株和M41株活跃；用ELISA方法将相同毒株细胞毒和鸡胚尿囊液毒免疫鸡产生的抗体S/P值(大于0.2判为阳性)进行比较发现,H120细胞毒抗体S/P值在免疫后14天为-0.01,与鸡胚尿囊液毒相同,在免疫后21、28天为0.153、0.282,略大于鸡胚尿囊液毒的0.071、0.216,而免疫后35天为0.31,小于后者的0.385；W93细胞毒的抗体S/P值在免疫后14、21、35天为-0.02、0.02、0.261,均小于鸡胚尿囊液毒的-0.001、0.039、0.37,而在免疫后28天,两者抗体值相等,均为0.141；H52细胞毒的抗体S/P值在免疫后14、21、35天为0.246、0.815、1.044,均低于鸡胚尿囊液毒的0.307、0.964、1.154,而在免疫后28天前者为1.269,略高于后者的1.128；免疫后14、21、28、35天,M41株细胞毒的抗体S/P值分别为0.108、0.189、0.544、0.828,均高于鸡胚尿囊液毒-0.03、0.011、0.34、0.808抗体S/P值。通过上述结果发现,M41株病毒适应细胞较快,细胞毒的病毒含量高、遗传变异相对稳定,免疫鸡产生的ELISA抗体均高于同期M41鸡胚尿囊液毒,显示了较好的细胞适应性和免疫原性。本实验通过构建重组质粒作为定量标准品、优化反应体系、建立标准曲线,建立了鸡传染性支气管炎病毒荧光定量检测方法(IBV FQ-PCR),分析与鸡胚半数感染量(EID50)方法的相关性,并用该方法监测IBV疫苗株H120、W93、H52和M41在鸡胚肾(CEK)细胞传代过程中病毒含量的变化,研究不同接毒量和不同收毒时间细胞毒病毒含量的差异。结果表明,IBV FQ-PCR标准曲线相关系数为0.995；重复性试验的变异系数小于0.0805；可检测到初始模板中2.916×10拷贝/μL的病毒核酸,检测灵敏度为常规PCR检测灵敏度的10倍；与其他禽源病毒如鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)、网状内皮组织增生病毒(REV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)均无交叉反应；证明IBV FQ-PCR具有良好的稳定性、灵敏性和特异性。通过对IBVFQ-PCR方法与EID50方法进行相关性分析,发现两种方法所得数据之间的相关系数为r=0.748,相关系数显著性检验(t检验)t值为4.653,大于t0.01(20-2)的3.922,说明两者相关性极显著；同时建立两种方法检测病毒含量的平行关系并得到回归方程。使用该方法检测病毒在CEK细胞传代过程中病毒含量的变化,发现在CEK上传代过程(1-25代)中,CEK细胞毒的优势代次是第16-18代,病毒含量较高；研究IBV M41株CEK细胞毒不同接毒量和收毒时间病毒含量差异发现,用病毒滴度为106.87EID50/0.1mL的M41(E11P18)细胞毒,接毒量为0.1mL,接毒后培养24-36h时,细胞毒病毒含量较高。综上,本实验成功将IBV H120、W93、H52、M41株在CEK细胞上培养适应,获得各代次细胞毒,确定了CEK细胞毒的血凝性、毒力、遗传变异特性及免疫原性等生物学特性,并证实M41株较其他3个疫苗株有较好的细胞适应性和免疫原性,为今后IBV在细胞内的变异研究及今后细胞源疫苗的研发奠定基础。此外,成功建立了IBV FQ-PCR方法及与EID50方法的平行关系,用于传代过程中病毒含量变化的快速监测及病毒的培养条件筛选研究等方面,有较高的实用价值。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章引言  10-27
  1 研究目的和意义  10
  2 国内外研究现状  10-27
    2.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学特点  11-15
    2.2 IBV的鉴定分型方法  15-17
    2.3 鸡传染性支气管炎病毒变异研究进展  17-18
    2.4 促进病毒适应细胞生长的方法  18-21
    2.5 荧光定量检测方法研究进展  21-27
第二章试验部分  27-68
  第一部分鸡传染性支气管炎疫苗株鸡胚肾细胞培养及生物学特性的研究  27-49
    摘要  27-28
    1 试验材料  28-31
    2 试验方法  31-36
    3 试验结果  36-46
    4 讨论与小结  46-49
  第二部分鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR的建立及其对鸡胚肾细胞传代培养中病毒的检测  49-68
    摘要  49
    1 试验材料  49-50
    2 试验方法  50-53
    3 试验结果  53-66
    4 讨论与小结  66-68
第三章结论  68-69
  1 主要结论  68
  2 创新点  68
  3 有待进一步解决的问题  68-69
参考文献  69-74
附录 IBV S1基因核苷酸和氨基酸序列比对结果  74-86
致谢  86-87
作者简历  87

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