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猪血凝性脑脊髓炎病毒S1蛋白受体的初步鉴定

作　者: 赵传博
导　师: 高丰
学　校: 吉林大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 血凝性脑脊髓炎病毒（HEV） S1蛋白 真核表达 免疫共沉淀
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猪血凝性脑脊髓炎（porcine hemagglutinating encephalomyelitis）是由血凝性脑脊髓炎病毒（hemagglutinating encephalomyelitis virus, HEV）引起的仔猪的一种急性、高度接触性传染病。HEV属冠状病毒属的成员，其主要侵害1～3周龄仔猪，临床上感染猪以呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20%～100%。自1958年本病在加拿大首次暴发以来，多数国家均有此病的报道。目前HEV的致病机制尚不明确，而HEV感染细胞的过程也未被明确的阐述，所以如果能找到HEV易感细胞受体，则有希望了解HEV感染细胞的整个过程，可以从分子水平上找到HEV的信号通路，对于HEV致病机制的了解以及从分子水平上防治该病有重大意义。HEV能够感染小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a），并能在N2a细胞系进行繁殖，说明N2a细胞膜表面具有HEV病毒的受体。研究表明冠状病毒表面的纤突蛋白S（Spike）能够识别病毒易感细胞的受体并与之相结合，从而改变细胞膜的通透性，介导病毒侵入细胞并进行增殖。S蛋白主要分为S1和S2两部分，S2蛋白的主要功能是将S蛋白连接到冠状病毒囊膜表面。S1蛋白包含受体结合域（RBD），主要参与S蛋白与易感细胞受体的结合过程。根据这一理论，本实验首先复苏了两株抗S1蛋白的单克隆抗体，抗体效价最高能够达到1:10240；构建了重组pcDNA3.1-HEV-S1真核表达载体，将重组载体通过转染Hela细胞，建立了S1蛋白的哺乳动物细胞真核表达系统，使表达的S1蛋白具有天然蛋白的复杂构象。经过鉴定，建立的Hela细胞真核表达体系S1蛋白的表达效率为28.4%， S1蛋白大小为87.56kD；同时，提取N2a细胞膜的总蛋白，利用表达的S1蛋白和N2a细胞膜总蛋白进行相互作用；用制备的抗S1蛋白的单克隆抗体，采用免疫共沉淀的方法，分离出能够和S1蛋白相互作用的N2a细胞膜蛋白即为可能的受体蛋白。用SDS-PAGE的方法分离蛋白复合物后，在65KD附近有明显的蛋白条带，疑似该位置的蛋白可能是HEV在N2a细胞膜上的受体，将该条带剪切后进行质谱分析，得到gi|74000677和gi|297266829这两部分为丙酮酸激酶同工酶M1/M2-1亚型，而其他部分则为结构蛋白，根据这一结果推测该未知蛋白为丙酮酸激酶。因此得出结论，丙酮酸激酶可能是HEV在N2a细胞上的受体。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
英文缩写词表  9-10
引言  10-12
第一篇 文献综述  12-27
  第一章 冠状病毒 S 蛋白研究进展  12-23
    1.1 冠状病毒基本结构  12-13
    1.2 冠状病毒感染细胞过程  13-14
    1.3 病毒表面蛋白致病机制  14-18
    1.4 S 蛋白在发病机制中的作用  18-23
  第二章 病毒受体的研究方法  23-27
    2.1 筛选敏感细胞的 cDNA 文库鉴别受体蛋白  23-24
    2.2 直接鉴别病毒与细胞膜偶联的蛋白  24
    2.3 特异性单克隆抗体筛选病毒受体  24-25
    2.4 抗独特型抗体模拟病毒结合识别受体  25
    2.5 根据既有知识推断病毒受体并进行鉴定  25
    2.6 免疫共沉淀方法鉴定病毒受体  25-27
第二篇 研究内容  27-55
  第一章 单克隆抗体的制备及抗体效价测定  27-33
    1.1 材料与方法  27-29
    1.2 实验结果  29-31
    1.3 讨论  31-32
    1.4 小结  32-33
  第二章 猪血凝性脑脊髓炎病毒 S1 蛋白的真核表达  33-48
    2.1 材料和方法  33-40
    2.2 结果  40-45
    2.3 讨论  45-46
    2.4 小结  46-48
  第三章 猪血凝性脑脊髓炎病毒神经细胞受体的初步鉴定  48-55
    3.1 材料和方法  48-50
    3.2 结果  50-52
    3.3 讨论  52-54
    3.4 小结  54-55
结论  55-56
参考文献  56-65
攻读硕士期间发表的学术论文及其他成果  65-66
导师简介  66-67
作者简介  67-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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