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山东省禽源致病性大肠杆菌喹诺酮类药物耐药基因qnrS的PCR检测及对其耐药质粒的耐药性比较

作　者: 苏晶
导　师: 姜世金
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 大肠杆菌喹诺酮类药物耐药性耐药质粒 qnrS基因套式PCR
分类号: S859
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

喹喏酮类药物广泛应用于治疗全身感染性疾病，在国内临床用药中其使用量位居第2位，仅次于β内酰胺类抗生素。近年来，细菌对此类抗生素的耐药率不断上升，且已出现了同时耐其他药物的多重耐药菌株的流行，尤其在人医和兽医临床常见的大肠杆菌中，喹诺酮类药物的耐药机制正变得日趋复杂。对大肠杆菌中的喹诺酮类药物质粒介导耐药基因进行流行病学检测与鉴定，有利于进一步了解细菌耐喹喏酮类药物的分子机理，指导临床用药。本研究主要包括以下内容：1、大肠杆菌喹诺酮类药物耐药基因qnr的流行性检测为了解山东省禽源致病性大肠杆菌中质粒携带喹诺酮类药物耐药基因的分布情况，对2004-2011年间分离的230株禽源致病性大肠杆菌进行了qnrA、qnrB和qnrS基因的PCR检测，结果发现qnrS基因的检出率为25.22%(58/230)，而qnrA和qnrB基因均未检出。对24株检出的qnrS基因测序后发现有16株为阳性（16/24），8株为假阳性（8/24），假阳性率较高。16株阳性菌株qnrS基因的序列与GenBankTM登录号JF773350的序列同源性在98.1%～98.8%之间。16株阳性菌株的GenBankTM登录号为JQ993348-JQ993363。为了提高检测的特异性，本研究建立了检测qnrS基因的套式PCR方法，测序结果表明该方法检出准确率为100%，证明套式PCR方法检测qnrS基因彻底消除了普通PCR检测的非特异性问题。使用该方法检出230株细菌中qnrS基因的携带率为16.52%（38/230），表明携带qnrS基因的耐药质粒在山东省禽源致病性大肠杆菌中分布较为广泛。2、喹诺酮类药物耐药质粒的分离鉴定及其介导耐药性的比较根据试验一的结果，选取EDFF、YDA38、MJ071107、TZ-A、ED127、ED437、TAJ-1和ED039等8株大肠杆菌，采用碱裂解法提取质粒，并将提取的质粒连续转化大肠杆菌DH5α三次，以保证其稳定遗传。结果8株细菌均提取出了耐药质粒，通过试验一的PCR方法检测，结果均为qnrS基因检测阳性。采用WHO推荐的纸片法对转化后的DH5α与空白DH5α进行33种药物敏感性实验药敏试验，采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法对携带耐药质粒的DH5α与DH5α进行了环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星和加替沙星等四种喹诺酮药物的最低抑菌浓度（MIC）的比较测定。结果显示携带耐药质粒的DH5α的对喹诺酮类药物的耐药性由敏感转增至中介（WHO推荐的比较标准），环丙沙星和诺氟沙星，左氧氟沙星和诺氟沙星的MIC值增加了2—32倍不等。本研究结果证明该携带qnrS基因的耐药质粒介导了细菌对喹诺酮类药物耐药性。

全文目录

中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 前言  12-27
  1.1 大肠杆菌的基本特性  12-13
  1.2 大肠杆菌的抗原特性  13-14
  1.3 大肠杆菌的致病性  14-17
    1.3.1 致病物质  14-15
    1.3.2 临床表现  15-17
  1.4 喹诺酮类药物的作用历史  17-18
  1.5 喹诺酮类药物的种类及其抗菌作用  18-21
    1.5.1 环丙沙星  18-19
    1.5.2 诺氟沙星  19
    1.5.3 氧氟沙星  19
    1.5.4 恩诺沙星  19
    1.5.5 培氟沙星  19-20
    1.5.6 西他沙星  20
    1.5.7 加雷沙星  20
    1.5.8 贝西沙星  20
    1.5.9 安妥沙星  20
    1.5.10 Delafloxacin  20-21
    1.5.11 非那沙星  21
    1.5.12 奈诺沙星  21
    1.5.13. 奥泽沙星  21
  1.6 喹诺酮类药物的作用机制  21-22
    1.6.1 喹诺酮类药物进入细胞的方式  22
    1.6.2 喹诺酮类抗菌药物作用机制  22
  1.7 耐药性机制  22-25
    1.7.1 细菌细胞膜通透性改变  22-23
    1.7.2 作用的靶分子——Ⅱ型拓扑异构酶变异  23
    1.7.3 主动外排  23-24
    1.7.4 质粒介导的细菌对喹诺酮类耐药  24-25
  1.8 套式 PCR 简介  25-26
  1.9 本研究的目的意义  26-27
2 材料及方法  27-38
  2.1 质粒介导喹诺酮类药物耐药基因 QNRA、QNRB 和 QNRS 的流行性检测与克隆测序  27-32
    2.1.1 试验菌株和药敏质控菌株  27
    2.1.2 细菌生长培养基  27
    2.1.3 分子生物学试剂  27
    2.1.4 电泳缓冲液  27
    2.1.5 琼脂糖凝胶的配制  27
    2.1.6 实验仪器设备  27
    2.1.7 引物的设计及合成  27-28
    2.1.8 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳  28-29
    2.1.9 qnr 基因克隆测序  29-32
  2.2 qnrS 基因套式 PCR 检测方法的建立  32-34
    2.2.1 试验菌株和药敏质控菌株  32
    2.2.2 细菌生长培养基  32
    2.2.3 分子生物学试剂  32
    2.2.4 电泳缓冲液  32
    2.2.5 琼脂糖凝胶的配制  32
    2.2.6 实验仪器设备  32-33
    2.2.7 引物的设计及合成  33
    2.2.8 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳  33-34
    2.2.9 阳性克隆序列测定  34
  2.3 喹诺酮类药物耐药质粒的分离鉴定及其介导耐药性的比较  34-38
    2.3.1 试验菌株与受体菌  34
    2.3.2 供试药物及培养基  34
    2.3.3 耐药质粒提取  34-35
    2.3.4 耐药质粒的转化  35-36
    2.3.5 耐药质粒的耐药性比较  36-38
3 结果  38-46
  3.1 质粒介导喹诺酮类药物耐药基因 QNRA、QNRB 和 QNRS 的流行性检测与克隆测序  38-41
    3.1.1 230 株大肠杆菌经 PCR 扩增的检测结果  38-39
    3.1.2 阳性产物克隆测序  39-41
  3.2 qnrS 基因套式 PCR 检测结果  41-42
  3.3 喹诺酮类耐药质粒提取及耐药性比较  42-46
    3.3.1 试验 2.3.3 的耐药质粒提取结果  42
    3.3.2 质粒的耐药性比较  42-46
4 讨论  46-49
  4.1 质粒介导喹诺酮类药物耐药基因 QNRA、QNRB 和 QNRS 的流行性检测与克隆测序  46-47
  4.2 QNRS 基因套式 PCR 检测方法的建立  47
  4.3 喹诺酮类药物耐药质粒的分离鉴定及其介导耐药性比较  47-49
5 结论  49-50
参考文献  50-60
致谢  60-61
攻读硕士期间发表论文情况  61

山东省禽源致病性大肠杆菌喹诺酮类药物耐药基因qnrS的PCR检测及对其耐药质粒的耐药性比较

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