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鸡枞菌多糖的免疫调节作用及其注射液的研制
作 者: 王思芦
导 师: 汪开毓
学 校: 四川农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: 鸡枞菌多糖 细胞免疫 免疫调节 注射液 免疫佐剂
分类号: S853.7
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
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鸡枞菌(Termitomyces albuminosus (Berk.) Heim., TA)是四川省凉山州著名的一种食用菌,因其富含多种营养成分,味道鲜美,因而受到人们的关注。对于鸡枞菌多糖(TAP)的提取纯化及生物学活性研究国内外报道较少,以其为主原料的动物保健品或免疫佐剂目前还未见报道。本论文以TAP为研究对象,从体外、体内两个方面研究其对动物机体的免疫调节作用和机理,开发出TAP注射液,为其作为一种新型的多糖类免疫佐剂应用于临床提供试验依据。论文分为以下6个部分：1.旨在更经济、安全、高效的分离、纯化TAP,本试验通过对提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行单因素试验及正交试验得出最佳热水浸提工艺；通过结合超声波法和热水浸提法提取多糖；以冻融法及Sevage法除蛋白,H202氧化法脱色,透析法等方法纯化多糖；采用α-萘酚乙醇法及甲醇法对多糖进行定性,硫酸苯酚法对多糖进行定量分析。结果表明TAP热水浸提的最佳工艺为80。C、料液比1：20、提取1h,共提取2次；结合20kHz的超声波提取可显著缩短提取时间并提高多糖得率。TAP的纯化物为浅褐色膏状体,定性实验表明所得物质为多糖类物质；鸡枞菌中纯化TAP的提取率为6.69%,纯化TAP的含糖量为92.17%。2.为阐明TAP对T细胞免疫功能的影响及其作用机制,本试验将TAP体外作用小鼠脾淋巴细胞,用MTT法检测TAP对淋巴细胞的增殖作用,ELISA法检测淋巴细胞IL-4、IL-2及IFN-γ分泌量,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测以上细胞因子mRNA表达量。结果表明,TAP可单独以及协同ConA或LPS促进脾淋巴细胞增殖；与ConA组比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进脾细胞IL-2、 IL-4及IFN-γ的分泌(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的脾细胞中CD4+%(P<0.01)、升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。结果提示,TAP对T细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。3.为了探讨TAP对正常及免疫抑制小鼠免疫功能的影响及其机理,本试验以黄芪多糖(APS)为阳性药物,用环磷酰胺(CTX)制备小鼠免疫抑制模型,检测了不同剂量的TAP对正常小鼠的免疫器官指数、血清溶血素水平、巨噬细胞吞噬功能及对免疫抑制小鼠的以上指标和T淋巴细胞亚群、外周血IL-4、IL-2及IFN-γ,脾淋巴细胞增殖、免疫器官组织病理学变化等免疫指标的影响。结果表明,20mg/kgTAP可显著提高正常及免疫抑制小鼠的溶血素(P<0.01)、免疫器官指数(P<0.01或P<0.05)及巨噬细胞吞噬功能(P<0.01)；与模型组相比,20mg/kgTAP还可降低免疫抑制小鼠的CD4+/CD8+比值(P<0.01),并使外周血IL-2、IFN-γ水平分别上升312.3%(P<0.01)和88.38%(P<0.01),使IL-4水平降低40.30%(P<0.01),可在体外显著促进淋巴细胞增殖(P<0.01),减轻CTX引起的免疫器官病变。TAP与相同剂量的APS相比具有相当或更显著的免疫调节作用。结果显示,TAP能明显拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用,提高小鼠体液及细胞免疫功能,促进紊乱的免疫功能恢复平衡。4.为了探讨TAP注射液的制备方法、质量控制及其稳定性,本试验在无菌条件下通过过滤除菌法制备TAP注射液,并按照注射剂的相关质量要求对其进行鞣质、PH值、无菌、热原及澄明度的检测；以硫酸苯酚法测定其多糖含量,费林试剂法测定单糖含量；另检测了强光及高热对TAP注射液的影响,通过经典恒温法初步估算TAP注射液的有效期。结果表明,TAP注射液的以上质量控制指标均符合注射剂的基本要求；其多糖含量为标示量的99.2-99.9%,未检测出含有单糖；强光和高温均能引起TAP出现不同程度的降解；TAP注射液在25℃避光下保存其稳定性较好,有效期为4.3年。5.为了保证TAP注射液在临床使用的安全性,对其进行了急性、亚慢性毒性试验,局部刺激,过敏及溶血试验。结果表明,在急性毒性试验中TAP注射液在对小鼠162.5～6000mg/Kg体重的剂量范围内不能测出其半数致死量LD50；在亚慢性毒性试验中,25～100mg/kg TAP均未引起小鼠生理及行为异常和免疫器官病变；TAP注射液对眼结膜和肌肉无刺激性,不引起过敏和溶血反应。TAP注射液可以用于皮下或肌肉注射给药,无毒副作用。6.为探讨TAP注射液对疫苗免疫效果的影响,以黄芪多糖(APS)注射液为阳性对照,通过间接血凝试验检测仔猪的口蹄疫抗体水平,用动物血细胞分析仪对免疫仔猪外周血白细胞总数,中性、单核细胞及淋巴细胞数进行了检测；同时又通过血凝抑制试验对新城疫弱毒苗免疫雏鸡的抗体水平及免疫器官指数进行了检测。结果表明,在口蹄疫疫苗首免后58d内,高剂量TAP能显著提高仔猪口蹄疫抗体水平和以上血液生理指标(P<0.01),此后随着时间延长这种作用逐渐减弱；在新城疫疫苗首免后35d内,中剂量TAP可显著提高雏鸡新城疫抗体水平并促进雏鸡免疫器官发育(P<0.01)。中高剂量TAP的免疫增强效果优于相同剂量的APS。综上所述,TAP是一种良好的免疫增强剂,可以拮抗环磷酰胺对机体的毒副作用；TAP注射液安全有效,在临床上可通过皮下或肌肉注射与常规疫苗配合使用以增强其免疫效果,TAP有望成为一种新型免疫佐剂。
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全文目录
摘要 4-7
Abstract 7-18
第一章 文献综述 18-35
1 真菌多糖免疫调节作用及机制研究进展 18-26
1.1 促进免疫器官发育 18-19
1.2 促进体液免疫功能 19-20
1.3 增强T细胞免疫功能 20-21
1.4 增强单核吞噬细胞功能 21-22
1.5 提高红细胞免疫功能 22
1.6 促进细胞因子产生 22-23
1.7 影响淋巴细胞信号转导 23-25
1.7.1 影响淋巴细胞钙离子转导 23-24
1.7.2 调节cAMP、cGMP活性 24-25
1.7.3 调节巨噬细胞的一氧化氮含量 25
1.8 真菌多糖作为免疫增强剂应用前景展望 25-26
2 兽用免疫增强剂研究进展 26-31
2.1 免疫增强剂分类 26-27
2.2 新型兽用免疫佐剂 27-30
2.2.1 免疫刺激复合物佐剂 27
2.2.2 脂质体佐剂 27-28
2.2.3 细胞因子类佐剂 28-29
2.2.4 胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸佐剂 29
2.2.5 天然产物佐剂 29-30
2.3 免疫增强剂存在的问题及展望 30-31
3 鸡枞菌研究进展 31-33
3.1 鸡枞菌生态特点与分布 31
3.2 鸡枞菌分类和形态学鉴定 31-32
3.3 鸡枞菌生物学活性物质研究 32-33
3.4 鸡枞菌的开发前景 33
4 选题依据和意义 33-35
第二章 鸡枞菌多糖分离纯化工艺研究 35-45
1 试验材料 35
1.1 主要药品与试剂 35
1.2 主要仪器 35
2 方法 35-38
2.1 鸡枞菌粗多糖提取工艺的单因素研究 35-36
2.1.1 温度对粗多糖得率的影响 35-36
2.1.2 液料比对粗多糖得率的影响 36
2.1.3 提取时间对粗多糖得率的影响 36
2.1.4 提取次数对粗多糖得率的影响 36
2.2 鸡枞菌粗多糖的提取工艺正交试验 36
2.3 超声波法与热水浸提法的粗多糖提取率比较试验 36-37
2.4 试验用精制多糖制备 37-38
2.4.1 冻融法除蛋白 37
2.4.2 Sevage法除蛋白 37
2.4.3 H_2O_2脱色 37
2.4.4 透析法去除小分子杂质 37
2.4.5 多糖定性试验 37
2.4.6 鸡枞菌多糖的糖含量测定 37-38
3 结果 38-42
3.1 单因素对粗多糖含量的影响 38-39
3.2 粗多糖提取工艺参数的正交试验结果 39-40
3.3 超声波法与热水浸提法提取粗多糖效果比较 40-41
3.4 精制多糖制备 41-42
3.4.1 定性试验 41
3.4.2 糖含量测定 41-42
4 讨论与小结 42-45
4.1 多糖提取工艺优化 42-43
4.2 多糖纯化工艺 43-44
4.3 小结 44-45
第三章 鸡枞菌多糖对小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响 45-63
1 试验材料 45-46
1.1 主要药品与试剂 45
1.2 试验动物 45
1.3 主要仪器 45-46
2 方法 46-48
2.1 鸡枞菌多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 46
2.1.1 脾淋巴细胞分离 46
2.1.2 TAP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 46
2.2 不同时间TAP对脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-Γ的影响 46-47
2.2.1 TAP对脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ的影响 46
2.2.2 TAP协同ConA对脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ的影响 46-47
2.3 TAP对体外培养小鼠T淋巴细胞CD3~+%及CD4~+/CD8~+的影响 47
2.4 TAP对脾淋巴细胞IL-4、IL-2、IFN-r MRNA表达的影响 47-48
2.4.1 脾淋巴细胞总mRNA提取 47
2.4.2 半定量RT-PCR法检测IL-4、IL-2、IFN-γ mRNA表达 47-48
2.5 数据分析 48
3 结果 48-60
3.1 TAP对脾淋巴细胞增殖的影响 48-49
3.2 TAP对脾淋巴细胞分泌IL-4、IFN-r、IL-2的影响 49-54
3.2.1 TAP单独使用时对脾淋巴细胞分泌IL-4、IFN-γγ、IL-2的影响 49-52
3.2.2 TAP协同ConA对脾淋巴细胞分泌IL-4、IFN-γ、IL-2的影响 52-54
3.3 TAP协同CONA对体外培养T淋巴细胞亚群的影响 54-56
3.4 体外培养脾淋巴细胞总RNA提取 56
3.5 TAP对体外培养淋巴细胞IL-4、IFN-Γ、IL-2 MRNA表达的影响 56-60
4 讨论与小结 60-63
4.1 TAP对脾淋巴细胞增殖的影响 60
4.2 TAP对T淋巴细胞分类的影响 60-61
4.3 TAP对细胞因子及其MRNA表达的影响 61-62
4.4 小结 62-63
第四章 鸡枞菌多糖在体内对小鼠免疫功能的影响 63-80
1 试验材料 63-64
1.1 主要药品与试剂 63-64
1.2 主要仪器 64
1.3 试验动物 64
2 方法 64-66
2.1 鸡枞菌多糖(TAP)对正常小鼠免疫功能的影响 64-65
2.1.1 TAP对正常小鼠溶血素及免疫器官指数的影响 64-65
2.1.2 TAP对正常小鼠巨噬细胞功能的影响 65
2.2 TAP对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 65-66
2.2.1 小鼠免疫抑制模型制备 65
2.2.2 腹腔巨噬细胞功能及免疫器官指数检测 65
2.2.3 外周血CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群检测 65
2.2.4 外周血溶血素及细胞因子IL-2,IL-4和IFN-γγ含量检测 65-66
2.2.5 脾淋巴细胞增殖试验 66
2.2.6 TAP对脾脏和胸腺组织病理学变化的影响 66
2.3 数据统计分析 66
3 结果 66-76
3.1 TAP对正常小鼠免疫功能的影响 66-68
3.1.1 TAP对溶血素及免疫器官指数的影响 66-67
3.1.2 TAP对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 67-68
3.2 TAP对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 68-76
3.2.1 TAP对腹腔巨噬细胞功能和免疫器官指数的影响 68-69
3.2.2 鸡枞菌多糖对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群的影响 69-71
3.2.3 TAP对免疫抑制小鼠血清溶血素和细胞因子的影响 71-72
3.2.4 鸡枞菌多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖的影响 72-73
3.2.5 TAP对免疫抑制小鼠脾脏和胸腺组织病理学变化的影响 73-76
4 讨论与小结 76-80
4.1 免疫抑制模型制作 76
4.2 TAP对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 76-77
4.3 TAP对小鼠血清溶血素的影响 77
4.4 TAP对小鼠免疫器官的影响 77
4.5 TAP对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响 77-78
4.6 TAP对免疫抑制小鼠淋巴细胞分类及细胞因子的影响 78-79
4.7 小结 79-80
第五章 鸡枞菌多糖注射液的制备、质量控制及稳定性试验 80-90
1 试验材料 80
1.1 主要药品与试剂 80
1.2 主要仪器 80
1.3 试验动物 80
2 方法 80-82
2.1 TAP注射液的制备 80
2.2 质量检查 80-82
2.2.1 鞣质检查 80
2.2.2 pH值检查 80-81
2.2.3 无菌检查 81
2.2.4 热原试验 81
2.2.5 澄明度检查 81
2.2.6 TAP注射液含糖量测定 81-82
2.2.7 费林试剂法测定TAP注射液单糖含量 82
2.3 稳定性试验 82
2.3.1 强光对TAP注射液的影响 82
2.3.2 高温对TAP注射液产品的影响 82
2.3.3 经典恒温法初步估算TAP注射液有效期 82
3 结果 82-87
3.1 TAP质量检查 82-84
3.1.1 鞣质检查 82-83
3.1.2 pH值检查 83
3.1.3 无菌检查 83
3.1.4 热原实验 83-84
3.1.5 澄明度检测 84
3.1.6 TAP注射液含糖量和单糖含量测定结果 84
3.2 稳定性试验 84-87
3.2.1 强光对TAP注射液的影响 84-85
3.2.2 高温对TAP注射液的影响 85
3.2.3 加速试验结果 85-87
4 讨论与小结 87-90
4.1 TAP注射液的制备工艺 87
4.2 TAP注射液的质量控制 87-88
4.3 TAP注射液有效期 88-89
4.4 小结 89-90
第六章 鸡枞菌多糖注射液安全性试验 90-98
1 试验材料 90
1.1 主要药品 90
1.2 试验动物 90
1.3 主要仪器 90
2 方法 90-93
2.1 急性毒性试验 90-91
2.2 亚慢性毒性试验 91
2.3 局部刺激试验 91-92
2.3.1 眼部刺激试验 91
2.3.2 肌肉刺激试验 91-92
2.4 过敏反应试验 92
2.5 溶血试验 92-93
3 结果 93-96
3.1 急性毒性试验 93
3.2 亚慢性毒性试验 93-95
3.3 局部刺激试验结果 95
3.3.1 眼部刺激试验结果 95
3.3.2 肌肉刺激试验结果 95
3.4 过敏试验结果 95
3.5 溶血试验结果 95-96
4. 讨论与小结 96-98
4.1 急、亚慢性毒性试验 96
4.2 局部刺激试验 96
4.3 过敏试验 96-97
4.4 溶血试验 97
4.5 小结 97-98
第七章 鸡枞菌多糖作为免疫佐剂对疫苗免疫效果的影响 98-111
1 试验材料 98
1.1 主要药品与试剂 98
1.2 主要仪器 98
1.3 试验动物 98
2 方法 98-101
2.1 TAP对猪口蹄疫灭活苗免疫效果的影响 99
2.1.1 动物分组与处理 99
2.1.2 正向间接血凝试验检测口蹄疫抗体效价 99
2.1.3 TAP对免疫仔猪外周血白细胞的影响 99
2.2 TAP对鸡新城疫弱毒苗免疫效果的影响 99-101
2.2.1 动物分组与处理 100
2.2.2 1%鸡红细胞悬液制备 100
2.2.3 血凝(HA)试验测定抗原效价 100
2.2.4 4单位凝集价抗原校正 100-101
2.2.5 血凝抑制(HI)试验检测新城疫抗体效价 101
2.2.6 免疫器官指数检测 101
2.3 数据分析 101
3 结果 101-106
3.1 TAP对口蹄疫油佐剂灭活苗免疫效果的影响 101-103
3.2 TAP对免疫仔猪外周血白细胞的影响 103-105
3.3 TAP对鸡新城疫弱毒苗免疫效果的影响 105-106
3.4 TAP对鸡免疫器官指数的影响 106
4 讨论与小结 106-111
4.1 TAP对灭活苗和弱毒苗免疫后抗体效价的影响 106-108
4.2 TAP对免疫仔猪血液生理指标的影响 108-109
4.3 TAP对免疫鸡体重及免疫器官的影响 109
4.4 小结 109-111
参考文献 111-124
致谢 124-125
攻读学位期间发表论文 125
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