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IKK2dn转染受者未成熟树突状细胞诱导产生的CD4~+CD25~-T细胞致耐受作用的实验研究

作　者: 杜科霖
导　师: 欧阳骏
学　校: 苏州大学
专　业: 外科学
关键词: IKK2dn 树突状细胞间接途径调节性T细胞免疫耐受
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:通过重组腺病毒介导的IKK2dn基因转染受者未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDC),并以此诱导产生CD4+CD25-T细胞,进而研究CD4+CD25-T细胞对免疫反应的影响,并分析细胞因子的变化。探讨转染IKK2dn基因的受者来源imDC诱导产生的CD4+CD25-T细胞致免疫耐受的特性及机制,从而为应用受者来源imDC诱导免疫耐受提供新的解决思路和方法。方法:本实验分两部分进行:第一部分,体外诱导培养Lewis大鼠(受者)来源的imDC,转染IKK2dn基因维持其未成熟状态,并以此诱导产生CD4+CD25-T细胞;第二部分,分选、收集CD4+CD25-T细胞,通过体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR),检测CD4+CD25-T细胞在MLR中的致耐受作用。具体实验方法如下:1、无菌提取大鼠(受者)双侧股骨、胫骨,获得骨髓源性单个核细胞,体外应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白介素-4 (interleukin-4, IL-4)诱导大鼠骨髓源性单个核细胞分化为imDC,并于第五天收集细胞; 2、分别用构建好的空载体腺病毒(Adv-0)、IKK2dn重组腺病毒载体(Adv-IKK2dn)转染imDC,获得Adv0-DC及IKK2dn-DC,采用Western blotting检测转染基因的表达情况,后与供者大鼠(Brown Norway, BN)抗原肽共孵育; 3、将获得的转染IKK2dn基因并负载供者抗原的imDC与受者T细胞共培养,并用流式细胞仪检测CD4+CD25-T细胞的产生情况; 4、采用免疫磁珠阴性加阳性分离法分选获得CD4+CD25-T细胞,体外进一步扩增培养;5、实验共分为阴性对照组、阳性对照组、Adv0-CD4+T细胞组(Adv0-DC诱导产生的T细胞)、IKK2dn-T细胞组(IKK2dn-DC诱导产生的CD4+CD25-T细胞)。分别以供者大鼠以及第三方大鼠制备的丝裂霉素C灭活的脾细胞作为刺激细胞,受者大鼠T细胞为反应细胞,通过MTT法观察CD4~+CD25-T细胞对异体抗原刺激所引起的受者T细胞增殖反应的调节能力。ELISA法检测细胞共培养后上清中IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β的水平。结果:1、我们成功培养获得了高浓度、纯度的imDC,每只大鼠股骨和胫骨骨髓分离后计数,约获得3.0×107单个核细胞,细胞活力检测>95%。成功培养的imDC呈疏松半悬浮生长,表面可见少许不规则的树枝状突起,体积较大,用透射电镜观察,细胞呈类圆形,胞浆丰富,细胞器多,细胞表面偶见少量突起,符合imDC超微结构特征,流式细胞仪检测细胞表型:CD80、CD86、MHC-II的表达阳性率较低,分别约为19.1±2.15%、17.0±1.60%和27.0±2.21%,与前期研究一致。培养第14天,CD86、MHC-II的表达阳性率明显增加(56.0±3.40%和66.5±1.40%),与第5天相比,差异有统计学意义(P<0.05)。2、在倒置荧光显微镜下可见转染腺病毒载体后的细胞膜表面染有绿色荧光,呈明显的不规则的毛刺样突起。采用Western blotting检测,结果显示转染IKK2dn后可以检测到分子量为87kDa的条带,证实成功转染imDC。初次MLR结果显示,转染IKK2dn并负载供者抗原的受者imDC刺激受者T细胞增殖能力低下,与负载供者抗原的未转染imDC以及转染空载体的imDC(Adv0-DC)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。3、受者Lewis大鼠骨髓源性imDC转染IKK2dn基因并负载BN大鼠抗原后可以在体外刺激诱导Lewis大鼠T细胞分化产生CD4~+CD25-T细胞,转染IKK2dn的imDC诱导产生的CD4~+T细胞中低表达CD25(18.5±1.40%),和对照组(72.2±3.30%)及Adv0-DC组相比(63.7±1.80%),差异均有统计学意义(P<0.05)。4、体外实验证明,转染IKK2dn并负载供者抗原受者imDC诱导产生的CD4~+CD25-T细胞能够抑制同种异体抗原刺激所引起的受者T细胞的增殖。当CD4~+CD25-T细胞为高比例时(CD4~+CD25-T/MLR),不仅能够抑制供者抗原刺激引起的T细胞增殖,而且抑制第三方抗原引起的T细胞增殖(P<0.05);当CD4~+CD25-T细胞为低比例时,此种抑制作用具有抗原特异性,仅对供者抗原引起的增殖反应具有抑制作用(P<0.05)。MLR上清中IL-10、TGF-β水平明显升高(P<0.05),IL-2、IFN-γ水平明显下降(P<0.05)。结论:1、转染IKK2dn基因并负载供者抗原的受者imDC可以诱导受者T细胞产生CD4~+CD25-T细胞,体外实验证实此种CD4~+CD25-T细胞能够诱导受者T细胞特异性低反应,具有诱导免疫耐受的作用。2、CD4~+CD25-T细胞诱导的免疫抑制功能具有供者抗原特异性,此种特异性与CD4~+CD25-T细胞所占比例有关,其作用机理与分泌高水平的细胞因子IL-10、TGF-β,抑制T细胞向效应性T细胞方向分化有关。3、体外应用低剂量细胞因子IL-4(5ng/ml)和GM-CSF(5ng/ml)可以高效的诱导培养足够数量及纯度的未成熟树突状细胞,为DC诱导免疫耐受提供了可能。4、Adv-IKK2dn转染受者imDC能够维持其未成熟状态,转染IKK2dn并负载供者抗原的imDC能够有效抑制受者T细胞的增殖反应,具有诱导免疫耐受的作用。

IKK2dn转染受者未成熟树突状细胞诱导产生的CD4~+CD25~-T细胞致耐受作用的实验研究

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