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鉴别诊断尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的LAMP方法的建立与初步应用

作　者: 刘庆
导　师: 路义鑫
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 吕氏泰勒虫 尤氏泰勒虫 环介导等温扩增技术 18S rRNA 鉴别诊断
分类号: S855.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


羊泰勒虫病(ovine and caprine theileriosis)是中国西北地区广泛分布的一类血液原虫病，该病危害严重，给养羊业造成重大经济损失。我国的羊泰勒虫病主要由两种泰勒虫引起——吕氏泰勒虫（T. luwenshuni）和尤氏泰勒虫（T. uilenbergi）（早期被认为是莱氏泰勒虫（T.lestoquardi））。大多数羊泰勒虫病例是属于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的混合感染，但是传统的方法很难区分开，因此找到快速准确的检测技术，用于鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的感染，成了现阶段的当务之急。本文主要是针对吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的18S rRNA基因序列高变区，分别设计4条特异地识别6个区域的LAMP引物。通过优化条件，扩增产物的序列测定，评价特异性和敏感性，同时经实验动物感染样品的评价，建立了一个可以鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法，并在小范围的流行病学调查中进行了初步的应用。研究结果表明：根据18S rRNA的基因序列设计的通用引物可以同时检测到吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，并且与其他的梨形虫无交叉反应。根据18S rRNA的基因序列设计的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性引物TC1、TC2，与羊的其它梨形虫无交叉反应，敏感性分别可以达到2pg/μL和2pg/μL。扩增产物测序分析显示目的片段的测序结果与NCBI上已经提交的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫18S rRNA序列对比完全吻合。本研究所建立的LAMP方法可以在试验羊攻蜱后14d检测出吕氏泰勒虫，尤氏泰勒虫泰勒虫13d可以检测出，均早于传统镜检的方法，说明该方法可以用于早期诊断。在对野外样品的检测中，广西省没有发现羊泰勒虫的感染；广东省、贵州省、重庆市仅检测出吕氏泰勒虫；甘肃省既发现了吕氏泰勒虫也检测出了尤氏泰勒虫，在92份检测样品中有21份为共同感染。本研究通过对所建立的LAMP方法的敏感性与特异性、在感染羊泰勒虫的动物中最早能检测出的时间对比以及野外样品的检测，证实本实验建立的鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的LAMP方法可以用于早期诊断、鉴别诊断、以及两种泰勒虫流行病学调查，可以在基层兽医机构推广，对确定我国羊泰勒虫分布有着实际应用意义。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-19
  1.1 泰勒虫的分类学地位  11-12
  1.2 泰勒虫的生活史  12-13
  1.3 病理变化与临床症状  13
  1.4 绵羊和山羊的主要泰勒虫  13-15
    1.4.1 莱氏泰勒虫（T. lestoquardi）  13-14
    1.4.2 绵羊泰勒虫（T. ovis）  14
    1.4.3 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫（T. luwenshuni & T. uilenbergi）  14-15
  1.5 羊泰勒虫诊断方法的研究进展  15-17
    1.5.1 血涂片染色镜检  15
    1.5.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）  15-16
    1.5.3 聚合酶链式反应(PCR)  16
    1.5.4 巢氏 PCR（Nested PCR）  16
    1.5.5 反向线性杂交（RLB）  16-17
    1.5.6 环介导等温扩增（LAMP）  17
  1.6 研究的目的与意义  17-19
2 材料与方法  19-27
  2.1 实验动物和蜱种  19
  2.2 主要仪器和试剂  19-20
    2.2.1 主要仪器  19-20
    2.2.2 主要试剂  20
    2.2.3 基因组 DNA 的提取  20
  2.3 试验动物的处理  20-21
    2.3.1 试验前准备  20
    2.3.2 试验用羊攻蜱  20
    2.3.3 血涂片检测  20-21
    2.3.4 全血的抽取与基因组的提取  21
  2.4 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的 LAMP 方法的建立  21-26
    2.4.1 引物设计  21-22
    2.4.2 LAMP 扩增  22-23
    2.4.3 反应条件的优化  23
    2.4.4 扩增产物的序列分析  23-25
    2.4.5 LAMP 方法与 PCR 方法的比较  25-26
  2.5 实验用羊病原检测  26
  2.6 流行病学调查  26-27
3 结果与分析  27-35
  3.1 LAMP 扩增结果  27-28
  3.2 LAMP 产物结果鉴定  28
  3.3 LAMP 的反应条件选择结果  28
  3.4 LAMP 及 PCR 特异性结果  28-30
  3.5 LAMP 及 PCR 敏感性结果  30-31
  3.6 实验用羊检测结果  31-33
  3.7 流行病学调查结果  33-35
4 讨论  35-38
  4.1 LAMP 方法的评价  35
  4.2 实验用羊感染情况  35-36
  4.3 流行病学调查  36-38
5 结论  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-45
附录  45-46
攻读硕士期间发表的学术论文  46

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医寄生虫病学
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