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亚洲玉米螟GOBPs和18SrRNA基因的克隆、序列分析与表达

作　者: 王海亭
导　师: 罗梅浩
学　校: 河南农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 亚洲玉米螟普通气味结合蛋白 18S rRNA基因序列分析基因表达
分类号: S435.132
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

嗅觉在昆虫寄主定位、取食、产卵、求偶等一系列行为反应中起着至关重要的作用。对昆虫嗅觉的研究,有利于探明昆虫行为的内在机制,阐释昆虫各种生命行为与寄主植物的协同进化机制,同时,还可以为研发与环境兼容性好,对天敌无害的高效害虫引诱剂和驱避剂提供依据。亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是玉米上的重要害虫。在玉米生长前期,多蛀食茎杆,致使被害植株严重失水、营养不良;抽雄后转至穗部为害,造成籽粒不饱、产量下降,常年损失10%~30%。本文以亚洲玉米螟为材料,利用分子生物学方法对其普通气味结合蛋白基因(general odorant binding protein,GOBPs)进行了克隆和表达。此外,从亚洲玉米螟基因组中成功克隆出了18S rRNA基因,为GOBPs基因表达的定量分析提供了重要内参。主要研究结果如下:1)利用RT-PCR和3’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从亚洲玉米螟触角中获得普通气味结合蛋白2(general odorant binding protein 2,GOBP2)基因,其开放阅读框架(open reading frame,ORF)为489 bp,编码162个氨基酸残基,预测分子量为18.3 kDa,等电点为5.09,命名为OfurGOBP2,Genbank登录号为DQ673101。预测N-末端疏水区包含由25个氨基酸组成的信号肽,氨基酸序列中有6个保守半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。同源性分析表明,OfurGOBP2与其他昆虫GOBP2的氨基酸一致性达70%以上,说明昆虫GOBP2分子进化具有明显的保守性。(2)根据Genbank已登录的其他鳞翅目昆虫GOBP1序列设计扩增亚洲玉米螟该基因片段的简并引物,利用RT-PCR技术通过克隆测序获得开放阅读框架386 bp,编码128个氨基酸残基,所得序列经过Blast分析与其他昆虫GOBP1基因有很高的相似性,同源性分析结果显示,鳞翅目昆虫间GOBP1具有较高的一致性,在50%以上,据此认为该序列是亚洲玉米螟GOBP1基因的部分序列。(3)从亚洲玉米螟基因组中克隆出18S rRNA基因,测序结果表明,所得序列长度为1901 bp,序列比对结果表明,该基因与其他昆虫的18S rRNA基因有较高的一致性,利用该结果与从Genbank筛选的部分六足总纲中其它目(纲)18S rRNA基因的全长序列和第二保守区段构建进化树进行比较,分析结果认为,采用第二区段进行系统发育研究更为可靠,在所列各目(纲)中毛翅目与鳞翅目的亲缘关系最近,该结果与传统分类相符。该基因已在Genbank登录,登录号为GU205787。(4)利用RT-PCR方法,以18S rRNA基因作为内参,研究了亚洲玉米螟GOBP1与GOBP2在不同发育期和不同组织的表达情况,结果表明,两者均在触角中特异性表达,雌雄间表达无差异,并且表达时间和规律一致,都是在中蛹期开始表达。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-25
  1.1 昆虫的嗅觉  9-21
    1.1.1 昆虫感知的气味化合物  9-10
    1.1.2 昆虫触角的化学感器  10-11
    1.1.3 昆虫嗅觉系统相关蛋白  11-19
      1.1.3.1 气味结合蛋白  11-14
      1.1.3.2 化学感受蛋白  14-16
      1.1.3.3 气味受体蛋白  16-17
      1.1.3.4 气味降解酶  17-18
      1.1.3.5 感觉神经元膜蛋白  18-19
    1.1.4 昆虫嗅觉系统识别气味的过程  19-21
      1.1.4.1 Perireceptor events  19-20
      1.1.4.2 信号传导过程（Transduction events）  20-21
  1.2 18S 核糖体 RNA 基因  21-25
    1.2.1 18S rRNA 基因在昆虫分子系统学研究中的应用  21-23
    1.2.2 18S rRNA 基因作为内参基因的应用  23-25
2 引言  25-26
3 材料与方法  26-38
  3.1 试验材料  26-29
    3.1.1 供试昆虫  26
    3.1.2 供试菌种及质粒  26
    3.1.3 主要试剂及工具酶  26
    3.1.4 供试试剂盒  26
    3.1.5 缓冲溶液  26-27
    3.1.6 培养基  27
    3.1.7 碱法小量质粒抽提液  27
    3.1.8 SDS-PAGE 电泳试剂  27-28
    3.1.9 Western blot 所用溶液  28
    3.1.10 其他溶液  28-29
  3.2 试验方法  29-38
    3.2.1 亚洲玉米螟 GOBPs 基因的克隆  29-32
      3.2.1.1 总 RNA 提取  29
      3.2.1.2 引物设计  29
      3.2.1.3 RT-PCR  29-30
      3.2.1.4 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测  30
      3.2.1.5 PCR 产物纯化  30
      3.2.1.6 质粒的连接  30-31
      3.2.1.7 感受态细胞的制备(CaCl_2 法)  31
      3.2.1.8 连接载体的转化  31
      3.2.1.9 阳性克隆的筛选  31
      3.2.1.10 质粒DNA 的提取  31-32
      3.2.1.11 重组质粒的酶切鉴定  32
      3.2.1.12 序列测定和分析  32
    3.2.2 3'RACE 获取GOBP2 3'末端序列  32-34
      3.2.2.1 总RNA 提取  32
      3.2.2.2 3'RACE 引物设计  32-33
      3.2.2.3 反转录反应  33
      3.2.2.4 套式PCR 反应  33-34
      3.2.2.5 3'RACE 其他步骤  34
    3.2.3 亚洲玉米螟18S rRNA 基因的克隆与序列分析  34-35
      3.2.3.1 亚洲玉米螟幼虫DNA 的提取  34-35
      3.2.3.2 引物设计  35
      3.2.3.3 PCR 扩增  35
      3.2.3.4 18S rRNA 克隆的其他步骤  35
    3.2.4 亚洲玉米螟GOBPs 基因表达的半定量分析  35-36
      3.2.4.1 不同龄期和不同组织总RNA 的提取  35
      3.2.4.2 总RNA 反转录cDNA  35-36
      3.2.4.3 引物设计  36
      3.2.4.4 PCR 扩增  36
      3.2.4.5 琼脂糖电泳检测  36
    3.2.5 GOBP2 抗血清特异性检测  36-38
4 结果与分析  38-53
  4.1 亚洲玉米螟GOBP2 基因的克隆  38
  4.2 亚洲玉米螟GOBP2 基因的序列测定和分析  38-43
    4.2.1 亚洲玉米螟GOBP2 序列测定  38-40
    4.2.2 亚洲玉米螟GOBP2 氨基酸序列多重联配和同源性比较  40-41
    4.2.3 OfurGOBP2 与其他昆虫GOBP2 系统发育树的构建  41-42
    4.2.4 亚洲玉米螟 GOBP2 亲脂性分析  42-43
  4.3 亚洲玉米螟GOBP1 基因片段的克隆  43
  4.4 亚洲玉米螟GOBP1 基因片段的序列测定和分析  43-46
    4.4.1 GOBP1 序列测定  43-44
    4.4.3 GOBP1 氨基酸多重联配和同源性分析  44-45
    4.4.3 OfurGOBP1 与其他昆虫GOBP1 系统发育树的构建  45-46
  4.5 亚洲玉米螟18S rRNA 基因的克隆  46-47
  4.6 亚洲玉米螟18S rRNA 基因序列测定和分析  47-52
    4.6.1 18S rRNA 基因序列测定  47-49
    4.6.2 基于18S rRNA 基因全长序列和第二保守区段构建发育树  49-52
  4.7 亚洲玉米螟GOBPs 基因表达的半定量分析  52
  4.8 亚洲玉米螟GOBP2 抗血清特异性检测  52-53
5 结论与讨论  53-56
  5.1 结论  53-54
  5.2 讨论  54-56
参考文献（References）  56-68
ABSTRACT  68-69

亚洲玉米螟GOBPs和18SrRNA基因的克隆、序列分析与表达

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