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Cj0440c基因在空肠弯曲杆菌耐药性和适应性中的作用

作　者: 方霞
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 空肠弯曲菌红霉素同源重组差异表达适应性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

空肠弯曲菌是一种重要的能引起人感染性腹泻的食源性致病菌。患者会出现急性和自限性肠炎,严重者还会出现全身性感染或者神经性疾病-格林巴利综合症。大环内酯类和氟喹诺酮类是临床上常用的抗弯曲杆菌感染的药物。而空肠弯曲菌对这两类药物的耐药问题日益严重。为了从源头上控制耐药弯曲菌的产生,我们必须了解清楚耐药菌的产生规律及其耐药性和适应性机制。本实验室前期研究发现,以标准菌NCTC11168做参照,Cj0440c在高水平红霉素耐药菌中过量表达,且根据NCBI提供的信息,获悉该基因是一种假定的广义调节子。本研究选取Cj0440c基因为研究对象,运用分子生物学技术将标准菌及红霉素诱导的耐药菌的Cj0440c基因敲除,通过基因芯片筛选出Cj0440c敲除前后的差异表达基因,运用生物信息学分析与Cj0440c相关联的基因,设计相关的表型实验以验证Cj0440c的作用,探讨Cj0440c基因在空肠弯曲杆菌耐药性和适应性中的作用。本课题的研究为生物信息库提供了有利数据,为防止弯曲菌耐药性的产生和传播提供了理论指导和支撑。1.耐药株的获取及相应突变体的构建为了探索未知基因Cj0440c的功能特征及其在耐药性和适应性中的作用机制。本研究采用逐步升浓度法体外诱导耐红霉素的空肠弯曲菌NCTC11168,并采用反向PCR构建Cj0440c的插入突变载体,用同源重组的原理分别构建标准菌NCTC11168及其红素诱导耐药菌的缺失突变体。以质粒pGEM-T easy为载体与目的基因片段连接。设计含有相同酶切位点的引物分别扩增载体片段和插入的卡那抗性片段,同酶分别处理后连接,得到Cj0440c缺失突变载体。经PCR、酶切和测序确证无误后转入相应的空肠弯曲菌中。NCTC11168突变株命名为SM,耐红霉素诱菌的突变株命名为RM。本研究欲尝试从另一个角度考证Cj0440c功能特征,还在pRY112-pABC载体的基础上成功构建了Cj0440c过表达载体,将该载体通过自然转化和电转化法转化于相应的空肠弯曲菌中实现过表达和补偿突变的目的,但是转化均未成功。后期结合基因的差异表达情况和突变株表型特征来阐述Cj0440c的功能。2.Cj0440c缺失突变后的差异表达基因为了深入分析Cj0440c的功能及其在耐药菌中发挥的作用机制,按上述结果以相应的母源菌为对照组,用基因芯片技术筛选缺失突变体中差异表达的基因。采用Real-time RT-PCR的方法对结果进行验证。设置四组生物学重复,经SAM分析后,SM组总共筛选得到19个差异基因。只有2个基因是上调表达,一个为flaA,另一个为假定的脂蛋白Cj1632c；16个下调表达基因中10个与鞭毛生物合成有关,参与鞭毛组装、细菌运动性、形成生物膜、自体凝集AAG及定植和侵袭的过程；另外4个下调表达基因与O-糖基化有关,影响着鞭毛糖基化修饰；其他2个为假定蛋白,文献相关报道其也是与鞭毛的运动性和毒性相关的。RM组共筛选得到9个差异基因。未发现上调表达的基因,9个下调基因中4个都是与鞭毛生物合成有关；另外4个未知基因报道与鞭毛蛋白相关或者与毒力蛋白相关；还有一个差异基因katA,是空肠弯曲菌唯一的过氧化氢酶,与抗氧化应激有关,可能有助于耐药空肠弯曲菌在肠道的定植及在表皮细胞内的生存。且RM中的两个差异基因(Cj1338c和Cj1242)在SM中也是显著下调表达的。根据SM中差异基因功能推测：Cj0440c正调控着鞭毛相关基因,但是flaA受Cj0440c负调控；Cj0440c影响了鞭毛的结构和其多种生物学功能包括运动性、AAG、形成生物膜及定植和侵袭能力；此外Cj0440c影响着糖基化过程,参与鞭毛蛋白的糖基化修饰,影响着空肠弯曲菌鞭毛丝的组装及鞭毛抗原多样性及定植能力。根据RM中差异情况,推测Cj0440c还是与鞭毛合成及定植和侵袭有关,而且Cj0440c还有助于耐药的空肠弯曲菌抵抗氧化应激、顺利定植和胞内生存。3.Cj0440c缺失突变株的表型特征为了从表型水平验证Cj0440c缺失对空肠弯曲菌造成的影响,进行了一系列的表型检测,包括考察突变株的生长力、药物敏感性、鞭毛形态、运动性及其在动物体内的定植和竞争定植情况。发现Cj0440c敲除后并未影响空肠弯曲菌对药物的敏感性。表明Cj0440c对弯曲菌药物敏感性没有影响；突变株在体外的生长情况略弱于母源菌,运动性也弱于母源菌,电镜观察SM鞭毛丝有断裂,RM的鞭毛消失,其在体内定植的情况明显比母源菌差,且在动物体内竞争定植也处于弱势状态,最终母源菌成为了优势菌。表明Cj0440c确实与鞭毛紧密相关,表型实验与芯片分析的推测一致,Cj0440c影响空肠弯曲菌的鞭毛合成、运动性及其在动物体内的定植能力。综上所述,本研究成功构建了用于空肠弯曲菌基因敲除的载体,运用同源重组的方法成功构建了Cj0440c缺失突变体,并对突变体进行了差异基因的筛选和相关表型检测。突变株的鞭毛受损或消失,运动性变弱,在动物体内的定植能力和竞争定植能力减弱,说明在临床条件下突变体很快会被其他优势菌群替代。据差异基因功能及表型实验,推测Cj0440c基因与鞭毛生物合成紧密相关,可能在鞭毛合成系统中正调节flaB、flaG、flgD、 flgE、flgE2、flgG、flgG2、flgH、flagI、flgK、flgL、 fliD及fliK,负调节flaA及Cj1362c,从而影响鞭毛的相关功能；此外Cj0440c的产物可能与鞭毛丝组成成分FlaA及FlaB关系紧密,在红霉素耐药株中与FlaB更紧密；Cj0440c可能还会影响鞭毛蛋白糖基化修饰,从而影响鞭毛蛋白的组装及细菌对宿主细胞的吸附和侵袭能力。空肠弯曲菌在耐受大环内酯类药物后,Cj0440c上调表达,有助于细菌快速运动逃逸药物压力,快速定植动物的胃肠道上皮细胞,有助于增加细菌抵抗氧化应激的能力,从而顺利侵袭表皮细胞,成功在细胞内生存和繁殖。总的来讲,Cj0440c有助于空肠弯曲菌在大环内酯类药物存在的环境中生存,增加了耐药菌的适应性。因此,本课题为空肠弯曲菌红霉素耐药研究提供了新的科学依据；为完善耐药机制拓宽了思路；为临床药物的研发及应用提供了参考。此外本研究成果中,一些未知功能的基因也得到了进一步阐述,为完善空肠弯曲菌基因组信息提供了有利证据。

全文目录

摘要  8-11
Abstract  11-15
縮略语表  15-16
1 前言  16-23
  1.1 研究背景  16-17
  1.2 研究进展  17-20
    1.2.1 耐药性机制  17-18
    1.2.2 适应性研究  18-20
    1.2.3 功能未知基因Cj0440c  20
  1.3 研究内容和目的意义  20-23
    1.3.1 研究思路  20-21
    1.3.2 研究内容  21-22
    1.3.3 研究技术路线  22
    1.3.4 研究目的与意义  22-23
2 材料与方法  23-44
  2.1 菌株及实验动物  23
  2.2 抗菌药物及配制  23-24
  2.3 培养基与试剂  24-27
  2.4 仪器设备  27
  2.5 耐红霉素空肠弯曲杆菌的诱导  27-28
  2.6 载体的构建  28-38
    2.6.1 载体构建方案  28-30
    2.6.2 突变载体的构建  30-36
    2.6.3 过表达载体的构建  36-38
  2.7 Cj0440c突变体的构建及过表达  38-40
    2.7.1 自然转化  38-39
    2.7.2 电转化  39
    2.7.3 突变体鉴定  39-40
  2.8 差异基因筛选  40-41
    2.8.1 基因芯片样品的准备  40
    2.8.2 差异表达基因的检测与分析及实时荧光定量验证  40-41
  2.9 表型检测  41-44
    2.9.1 生长力的测定  41-42
    2.9.2 药物敏感性测定  42
    2.9.3 鞭毛形态观察  42
    2.9.4 鞭毛迁移力的测定  42
    2.9.5 鸡体内定植能力的测定  42-43
    2.9.6 配对竞争实验  43-44
3 结果与分析  44-60
  3.1 载体的确证  44-45
    3.1.1 突变载体pCJ0440c-kan的确证  44
    3.1.2 过表达载体pRY112-CJ0440c的确证  44-45
  3.2 突变体的确证  45-48
    3.2.1 SM的验证  45-47
    3.2.2 RM的验证  47-48
  3.3 总RNA质量检验报告  48
  3.4 芯片结果分析  48-50
  3.5 差异片段序列分析  50-53
  3.6 实时荧光定量PCR验证  53-54
  3.7 表型结果  54-60
    3.7.1 生长力  54
    3.7.2 耐药性的检测  54-55
    3.7.3 空肠弯曲杆菌鞭毛形态的观察  55-56
    3.7.4 运动性的考察  56-58
    3.7.5 在鸡体内的定植能力  58
    3.7.6 在鸡体内成对竞争实验  58-60
4 讨论  60-72
  4.1 敏感菌和耐药菌突变体构建的探讨  60
  4.2 相关差异基因分析及Cj0440c功能推测  60-72
    4.2.1 细菌表面鞭毛成分代谢  61-65
    4.2.2 糖基化  65-67
    4.2.3 过氧化氢酶  67-68
    4.2.4 一些假定蛋白的功能推测  68
    4.2.5 Cj0440c在敏感菌和耐药菌中的不同作用  68-69
    4.2.6 Cj0440c对细菌与适应性的影响  69-72
5 全文总结  72-74
文献综述  74-107
  参考文献  86-107
致谢  107-109
附录  109-120
答辩委员所提问题  120-121

Cj0440c基因在空肠弯曲杆菌耐药性和适应性中的作用

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