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空肠弯曲菌鞭毛输出系统关键基因flhA突变株的构建及其功能的初步研究

作　者: 惠星星
导　师: 王小元
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 空肠弯曲菌 flhA 鞭毛 基因调节
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)为微需氧、无芽孢的革兰氏阴性弯曲短杆菌,是全球范围内人类感染性腹泻常见的食源性病原菌。鞭毛不仅是其运动器官,更是主要的毒力因子,在C. jejuni黏附、定殖、侵入肠上皮细胞以及毒力蛋白分泌外输过程中起重要作用。鞭毛输出系统是鞭毛合成、装配以及功能表现重要的结构基础,大部分研究认为鞭毛输出系统与革兰氏阴性细菌的Ⅲ型毒力蛋白分泌系统在进化上是同源的,基因组分析以及相关的实验研究初步显示,鞭毛输出系统很可能承担了C. jejuniⅢ型毒力蛋白的转运功能,与C. jejuni鞭毛致病性密切有关。为了深入探索鞭毛输出系统与鞭毛合成以及致病性关联的分子机制,本课题运用分子生物学手段构建了C. jejuni鞭毛输出系统关键基因flhA突变株(HXW001),并初步研究了flhA在毒力和分子调控方面的功能。1、flhA插入失活突变株HXW001的构建与鉴定本研究使用插入失活的方法构建空肠弯曲菌flhA突变株,首先在E.coil JM109中构建敲除载体pMD19-T-flhA-kanr。其次,使用电转化的方法将其导入到空肠弯曲菌中,利用同源重组获得突变株HXW001。2、突变株致病相关表型的初步研究主要包括生长性能、运动能力、菌体结构、自身凝集性(Autoagglutination)、菌膜形成能力等,初步解析C. jejuni flhA与毒力的相关性。结果表明,flhA的缺失,对菌体的生长性能并无明显影响,但是HXW001菌株的鞭毛缺失且丧失运动能力,生物膜形成能力和自身凝集现象明显下降,说明flhA是鞭毛结构和致病性重要的分子基础。3、flhA对鞭毛合成调节功能的初步研究通过荧光定量PCR的方法研究了flhA对主要鞭毛丝蛋白基因flaA、调节基因fliA(σ28)和rpoN (σ54)在转录水平上的调节功能,结果显示,flhA的缺失降低了鞭毛结构基因flaA和鞭毛合成第三级调节基因fliA的转录,对鞭毛合成第二级调节基因rpoN并无明显的影响,表明flhA不仅与鞭毛蛋白输出有关,而且对鞭毛丝蛋白及其调节因子具有转录水平的调控能力。4、flhA与Ⅲ型毒力蛋白胞内表达和胞外分泌相关性初步研究首先通过荧光定量PCR的方法研究了flhA对Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB在胞内转录水平的影响,结果表明,flhA并不影响Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB的胞内转录水平。其次研究了flhA对Ⅲ型毒力蛋白胞外分泌能力的影响,构建ciaB原核表达系统,并且制备和纯化了CiaB蛋白,用于制备CiaB的多克隆抗体,便于今后运用Western blot的方法定性观察flhA突变株HXW001与野生型在CiaB蛋白分泌能力上的差异程度。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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