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硒对鸡成肌细胞分化及骨骼肌炎症基因表达影响的研究

作　者: 吴琼
导　师: 徐世文
学　校: 东北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 硒鸡成肌细胞骨骼肌成肌调节因子炎症因子
分类号: S852.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

硒作为人和动物必需的微量元素，在肌肉的新陈代谢过程中起着重要的作用。肌肉是因缺硒受损的主要组织，硒缺乏能引起包括人类的多种动物骨骼肌和心肌纤维改变，从而导致以心肌和骨骼肌出现钙化、变性、血管损坏及出血等特征的疾病。硒在生物体内发挥生物学功能主要是通过硒蛋白发挥。硒蛋白W（Selenoprotein W，SelW）是硒蛋白家族中的重要成员，在骨骼肌和心肌中均高表达，并且对维持正常骨骼肌生理功能有重要作用。目前对哺乳动物SelW的研究已有相关报道，但对禽类SelW的研究，尤其是对与SelW相关的缺硒性肌病的研究甚少，并且对缺硒性肌病过程中的基因表达调控与发病机理的研究还是空白。本研究在建立缺硒鸡模型和原代培养成肌细胞的基础上，应用形态学观察、实时荧光定量PCR技术等，检测了培养基中添加不同水平硒（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M）添加后12、24、48和72h鸡骨骼肌成肌细胞的形态学变化、SelW和分化因子（Myf-5、Myogenin、MRF4）mRNA表达，并进行了相关性分析；分别对15、25、35、45和55日龄雏鸡的翅肌、胸肌及腿肌的SelW及炎症基因（NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2、PTGES）的mRNA表达量变化及相关性进行分析，结果表明：1．通过对原代培养鸡骨骼肌成肌细胞形态学特征变化的观察，表明培养基中添加适量的硒浓度（10-7M）能促进骨骼肌细胞分化进程，而过高的硒浓度10-5M）会显著抑制细胞分化，降低细胞活性。证明硒对鸡成肌细胞分化有重要作用，而过高的硒浓度添加会产生细胞毒性作用，抑制鸡成肌细胞分化。2．鸡胚成肌细胞中添加10-7M浓度硒时SelW mRNA表达量最高，即10-7M硒浓度是鸡胚成肌细胞SelW mRNA表达最佳硒添加浓度。培养基中硒浓度为10-5M时的鸡成肌细胞SelW mRNA表达有抑制作用。3．随培养基中硒浓的升高，三种调节因子Myf-5、Myogenin及MRF4mRNA水平呈先升高再降低的变化趋势，在10-7和10-8M硒浓度时出现表达量的最高峰值，然而硒浓度为过10-5M时成肌调节因子的mRNA表达量最低，这与形态学分析结果一致，提示适量硒添加促进鸡骨骼肌成肌细胞分化进程。Myf-5、Myogenin、MRF4与SelW mRNA均呈显著正相关，推测SelW可能在成肌细胞分化进程中发挥一定作用。4．低硒饲料能降低不同日龄鸡胸肌、翅肌、腿肌中SelW mRNA的表达，尤其在低硒组腿肌中其表达量显著降低。5．饲料中硒缺乏时不同日龄鸡骨骼肌组织中炎症基因NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2及PTGES mRNA表达量升高，提示这些炎症因子参与了缺硒性骨骼肌炎症的发生与发展。同时通过对炎症基因和SelW mRNA相关性分析，呈负相关，提示SelW参与了缺硒性骨骼肌炎症损伤过程。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-19
  1.1 硒的生物学功能  12-13
  1.2 硒与骨骼肌损伤  13
  1.3 硒蛋白与硒蛋白 W  13-15
    1.3.1 硒蛋白  13-14
    1.3.2 硒蛋白 W 的发现与分布  14-15
  1.4 骨骼肌的发育与再生  15-17
    1.4.1 成肌调节因子家族  16
    1.4.2 MRFs 在肌生成不同阶段中的作用  16-17
  1.5 炎症损伤机制  17-18
  1.6 实验的目的与意义  18-19
2 材料与方法  19-27
  2.1 主要仪器与试剂  19-21
    2.1.1 主要仪器  19-20
    2.1.2 主要试剂及配制  20-21
  2.2 鸡胚成肌细胞的原代培养与分组  21-22
    2.2.1 鸡胚的原代培养  21-22
    2.2.2 鸡胚原代培养成肌细胞的处理  22
  2.3 实验动物分组与处理  22-23
    2.3.1 实验动物分组  22-23
    2.3.2 样品采集处理  23
  2.4 检测指标与检测方法  23-26
    2.4.1 qPCR 法检测目的基因 mRNA 水平方法的建立  23-25
    2.4.2 硒对鸡胚成肌细胞形态学影响观察  25-26
  2.5 实验数据统计与分析  26-27
3 结果与分析  27-35
  3.1 硒对鸡胚成肌细胞形态学影响观察结果  27
  3.2 qPCR 法检测目的基因 mRNA 水平方法的建立  27-29
    3.2.1 总 RNA 的抽提与鉴定  27-28
    3.2.2 目的基因实时 qPCR 方法的鉴定  28-29
  3.3 硒对鸡成肌细胞 SelW 及分化相关基因 mRNA 表达影响检测结果  29-31
    3.3.1 硒对鸡成肌细胞 SelW mRNA 表达影响的检测结果  29-30
    3.3.2 硒对鸡成肌细胞分化相关基因 mRNA 表达影响的检测结果  30-31
  3.4 鸡成肌细胞分化因子和 SelW mRNA 表达水平之间的相关性分析结果  31-32
  3.5 硒对鸡骨骼肌 SelW 及炎症相关基因 mRNA 表达影响检测结果  32-34
    3.5.1 硒对不同日龄鸡肌肉组织 SelWmRNA 表达影响检测结果  32
    3.5.2 硒对不同日龄鸡肌肉组织炎症因子 mRNA 表达影响检测结果  32-34
  3.6 鸡肌肉组织炎症基因和 SelW mRNA 表达水平之间的相关性分析结果  34-35
4 讨论  35-42
  4.1 鸡骨骼肌成肌细胞的培养及形态学特征  35-36
    4.1.1 鸡骨骼肌成肌细胞的培养  35
    4.1.2 鸡胚成肌细胞形态学特征观察  35-36
  4.2 硒对鸡成肌细胞分化的影响  36-38
    4.2.1 硒对鸡成肌细胞 SelW 转录的影响  36-37
    4.2.2 硒对鸡成肌细胞分化因子转录的影响  37-38
  4.3 低硒日粮对鸡肌肉组织 SelW 及炎症因子转录水平的影响  38-42
    4.3.1 硒缺乏对鸡肌肉组织 SelW 转录的影响  38-39
    4.3.2 缺硒对鸡肌肉组织炎症因子转录的影响  39-42
5 结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-57
附录  57-64
攻读硕士学位期间发表的学术论文  64

硒对鸡成肌细胞分化及骨骼肌炎症基因表达影响的研究

内容摘要

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