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蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定

作　者: 刘慧
导　师: 刘淑英
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 蒙古绵羊滋养层细胞细胞培养逆转录聚合酶链式反应免疫组织化学透射电镜
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成成分,对胚胎的植入过程起重要的调节作用。本研究旨在进行体外培养、鉴定蒙古绵羊滋养层细胞(trophoblastic cells),并对其生物学特征进行探究,来建立一种能稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础。经过培养不同孕期(早、中、晚)的蒙古绵羊滋养层细胞,发现胎盘的采集时间对细胞的贴壁率及细胞活性影响较大,确定采集胎盘的最佳时期为孕中期。通过添加不同浓度的血清,筛选出含15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum FBS)的高糖DMEM培养体系较适合细胞生长。细胞培养初期,通过胰酶消化差速法,去除上皮样细胞中混杂的成纤维状细胞,并在5代之内得到纯化的细胞。应用伊红-苏木素染色法(HE),可观察到纯化的细胞形态多样,呈多角形或卵圆形,细胞界限清楚,胞浆透明,核圆或呈小泡状。使用免疫组织化学方法,分别检测不同孕期的正常绵羊胎盘绒毛组织,以及体外培养的滋养层细胞,结果显示,培养的滋养层细胞中细胞角蛋白呈阳性表达,波形蛋白呈阴性表达,证明细胞的纯度在90%以上,符合后续实验的要求纯度。应用透射电子显微镜观察绵羊绒毛膜滋养层细胞,观察结果显示,所培养的细胞具有滋养层细胞的典型结构,细胞表面有丰富的微绒毛,细胞质内线粒体较多,并可见电子密度较高的脂滴,细胞核较大,细胞间可见缝隙连接结构,提示所培养细胞为绵羊绒毛膜滋养层细胞。利用RT-PCR技术检测滋养层蛋白-1,结果显示,纯化的细胞能够表达滋养层蛋白-1。研究结果表明,本试验应用组织块培养法制备原代滋养层细胞,该方法简便易行,可以有效获得较高纯度的,且具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供细胞学基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-22
  1.1 绵羊滋养层细胞概述  9-11
    1.1.1 合体滋养细胞  9
    1.1.2 单核立方上皮细胞  9-10
    1.1.3 双核上皮细胞  10-11
  1.2 胎盘的形成及妊娠期的变化  11-13
  1.3 胎盘的功能  13
  1.4 胎盘的种类  13-14
  1.5 蒙古绵羊胚胎发育特征  14-15
  1.6 滋养层细胞的建系  15-17
    1.6.1 细胞系的建立方法  15
    1.6.2 BEWO细胞  15-17
  1.7 滋养层细胞的应用  17
  1.8 滋养层细胞的体外分离  17-20
    1.8.1 细胞分离方法  17-19
    1.8.2 滋养层细胞原代培养方法的缺陷  19-20
  1.9 原代培养滋养层细胞的质量鉴定  20-21
    1.9.1 细胞角蛋白  20
    1.9.2 波形纤维蛋白  20-21
    1.9.3 人绒毛膜促性腺激素  21
    1.9.4 绵羊滋养层蛋白-1  21
  1.10 研究意义  21-22
2 试验材料与方法  22-30
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 试验动物  22
    2.1.2 试验药品及试剂  22
    2.1.3 仪器设备  22-23
  2.2 试验方法  23-30
    2.2.1 试剂配置  23
    2.2.2 细胞的原代培养方法筛选  23-24
      2.2.2.1 组织块培养法  23-24
      2.2.2.2 消化法  24
    2.2.3 绵羊滋养层细胞纯化及活力检测  24-25
    2.2.4 不同的孕期对滋养层细胞的影响  25
    2.2.5 蒙古绵羊滋养层细胞培养体系的筛选  25
    2.2.6 细胞冻存试验  25-26
    2.2.7 滋养层细胞的复苏试验  26
    2.2.8 透射电镜观察  26-27
    2.2.9 细胞免疫组化染色  27
    2.2.10 HE染色  27-28
    2.2.11 PCR检测滋养蛋白-1  28-29
      2.2.11.1 细胞总RNA的提取  28
      2.2.11.2 cDNA合成  28-29
      2.2.11.3 PCR反应  29
    2.2.12 不同孕期的绵羊胎盘绒毛膜的免疫组化检测  29-30
3 结果  30-44
  3.1 培养方法筛选结果  30
  3.2 原代培养细胞的生长及形态观察  30-32
  3.3 胎龄对细胞活性的影响  32-33
  3.4 滋养层细胞培养体系的筛选  33-34
  3.5 滋养层细胞的冷冻及复苏对细胞的形态、活性的影响  34-35
  3.6 透射电镜观察滋养层细胞超微结构结构  35-37
  3.7 RNA分析与定量  37-38
  3.8 RT-PCR检测的结果  38
  3.9 绵羊胎盘绒毛膜免疫组化结果  38-44
4 讨论  44-46
5 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-53
作者简介  53

蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定

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