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凉山半细毛羊抑制素α亚基基因的克隆及成熟肽二聚体的构建

作　者: 朱时雅
导　师: 曾宪垠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 凉山半细毛羊抑制素α亚基生物信息学分析二聚体
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

抑制素(inhibin, INH)是一种由α和β两种亚单位通过二硫键聚集形成的异二聚体糖蛋白质激素,主要的生理作用是抑制促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)的合成和分泌。抑制素免疫能够升高体内FSH水平,既能促进雌性动物卵泡发育,提高排卵率和产仔数,又能使雄性动物性成熟提前和产精量增加,对提高动物繁殖性能有巨大的研究价值。根据GenBank收录的新疆细毛羊抑制素α亚基基因序列设计合成引物,以凉山半细毛羊卵巢总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得了凉山半细毛羊INH-α亚基cDNA片段,克隆至pMD19-T载体后进行生物信息学分析得知：凉山半细毛羊INH-α亚基基因大小为857bp,其中402个碱基编码134个氨基酸组成的成熟肽；成熟肽是一条亲水性膜外蛋白,含有生长转化因子β超家族的保守结构域,N端1-32位氨基酸可能是其抗原决定簇所在区域；INH-α亚基在各物种间高度保守,可能与某种重要生理功能相关。将凉山半细毛羊INH-α亚基成熟肽编码基因作为目的片段插入pRSET A载体的BamH Ⅰ及Sac Ⅰ两个酶切位点之间形成pR-INH单体,再根据同尾酶原理,经过BamH Ⅱ Hind Ⅲ及Bgl Ⅲ Hind Ⅱ消化,将其定向插入到pR-INH重组质粒的Bgl Ⅱ及Hind Ⅰ两个酶切位点之间构建pR-2INH二聚体,pR-INH及pR-2INH重组质粒均能在E.coli BL21(DE3)中诱导表达出融合蛋白,经渗透休克法初步纯化后用Western Blot验证其活性,结果表明,重组质粒pR-INH及pR-2INH所表达的融合蛋白均具有抑制素的免疫活性。本试验在抑制素传统免疫原的基础上加以改良,为高免疫原性疫苗的创制打下了坚实的基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章文献综述  8-22
  1 抑制素  8-17
    1.1 概述  8
    1.2 结构和特性  8-9
    1.3 表达合成  9-11
    1.4 抑制素的生理功能  11-13
    1.5 应用  13-17
  2 凉山半细毛羊  17-21
    2.1 品种选育  18
    2.2 体型外貌  18-19
    2.3 生产性能  19-20
    2.4 凉山半细毛羊养殖业前景及所面临的问题  20-21
  3 本研究的目的与意义  21-22
第二章凉山半细毛羊抑制素α亚基基因的克隆及生物信息学分析  22-38
  摘要  22-23
  1 材料与方法  23-28
    1.1 材料  23-25
    1.2 方法  25-28
  2 结果与分析  28-35
    2.1 凉山半细毛羊INH-α亚基基因的克隆  28-30
    2.2 凉山半细毛羊INH-α亚基基因的生物信息学分析  30-35
  3 讨论  35-37
    3.1 RT-PCR反应  35-36
    3.2 INH-α亚基基因克隆  36-37
    3.3 抑制素进化保守性分析  37
  4 本章小结  37-38
第三章凉山半细毛羊抑制素α亚基成熟肽二聚体的构建  38-66
  摘要  38
  1 材料与方法  38-52
    1.1 材料  38-43
    1.2 方法  43-52
  2 结果与分析  52-61
    2.1 INH-α亚基成熟肽编码基因的PCR  52-53
    2.2 INH-α亚基成熟肽编码基因单体及二聚体重组质粒的构建  53-55
    2.3 INH-α亚基成熟肽单体及二聚体融合蛋白的诱导表达  55-59
    2.4 INH-α亚基成熟肽单体及二聚体融合蛋白的纯化  59-60
    2.5 Western Blot分析  60-61
  3 讨论  61-65
    3.1 目的基因的选择  61-62
    3.2 酶切反应  62-63
    3.3 蛋白表达  63-65
  4 本章小结  65-66
结论  66-67
参考文献  67-73
致谢  73-74
攻读学位期间发表的学术论文目录  74

凉山半细毛羊抑制素α亚基基因的克隆及成熟肽二聚体的构建

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