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棉酚对多浪羊淋巴细胞核酸的影响及多浪羊IFN-γ克隆和表达

作　者: 左文斌
导　师: 高庆华
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉酚 淋巴细胞核酸 IFN-γ克隆 融合表达 抗原性
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本实验将棉酚作用于体外培养的多浪羊淋巴细胞,采用Trizol法提取棉酚作用于不同时间体外培养淋巴细胞的DNA和总RNA,根据核酸电泳结果,揭示棉酚对淋巴细胞凋亡影响的规律。结果表明：0.071mmol/L的棉酚作用于体外培养的淋巴细胞DNA3h开始降解,4h淋巴细胞DNA出现梯状条带,5h出现完全降解,0.071mol/L的棉酚作用于体外培养的淋巴细胞RNA1h、2h时,28S、18S均出现了涂抹,3h、4h、5h时,18S已降解。以新疆多浪羊淋巴细胞为实验材料,使用Trizol法提取其总RNA,以GenBank中NM001009803的：nRNA序列,用primer premier5.0软件辅助设计了多浪羊IFN-γ的基因,然后以淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR,反转录扩增出IFN-γ的目的基因。将RT-PCR产物切胶回收纯化后连接到pMD-18T克隆载体上转化DH5α,过夜培养,挑选阳性克隆菌,制成30%甘油菌,送北京博大泰克生物基因技术有限责任公司进行DNA序列测定。测序结果表明目的基因的核苷酸大小为582bp,通过多序列比对发现第391位核苷酸发生了突变。IFN-γ基因与pET-28c载体进行连接,酶切鉴定、PCR鉴定后确定,含有目的基因片段的原核表达载体pET-28c-IFN-γ构建成功。然后将重组原核表达载体pET-28c-IFN-γ转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导表达,表达出约24.4KDa融合蛋白。同时根据SDS-PAGE显示对融合蛋白进行表达条件的优化,最佳诱导温度是37℃,最佳诱导时间为4.0h,最适IPTG诱导浓度为1.5mmol/L。通过Bandscans.O软件分析融合蛋白的表达量,融合蛋白占菌体总蛋白的14.2%。用融合蛋白pET-28c-IFN-γ免疫家兔,在免疫后45天,Western-blot和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28c-IFN-γ能被家兔的阳性血清所识别,表达蛋白pET-28c-IFN-γ具有较好的反应原性和免疫原性。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
前言  10-11
第一章 文献综述  11-16
  1.1 概述  11
  1.2 棉酚对细胞的影响  11-12
  1.3 IFN-г简介  12-13
  1.4 IFN-г的国内外研究现状  13-14
  1.5 IFN-г的研究意义  14-15
  1.6 本课题研究的目的和意义  15-16
第二章 研究内容  16-48
  实验一 棉酚对多浪羊淋巴细胞核酸的影响研究  16-22
    1. 材料与方法  16-19
      1.1 材料  16-18
      1.2 方法  18-19
    2. 结果与分析  19-21
      2.1 核酸电泳结果  19-21
      2.2. 结果分析  21
    3. 讨论  21-22
  实验二 多浪羊IFN-γ基因克隆及核苷酸序列分析  22-33
    1. 材料与方法  22-27
      1.1 材料  22-23
      1.2 实验方法  23
      1.3 多浪羊IFN-γ基因的克隆  23-25
      1.4 克隆载体pMD-18T的构建及鉴定  25-27
    2. 结果与分析  27-30
      2.1 总RNA的提取结果鉴定  27
      2.2 IFN-γ基因的RT-PCR结果及分析  27-28
      2.3 IFN-γ-pMD-18T重组质粒结果鉴定及分析  28
      2.5 序列分析  28-30
    3. 结论  30-31
      3.1 总RNA提取  30
      3.2 目的基因扩增  30-31
      3.3 目的基因克隆  31
      3.4 目的基因的核苷酸序列分析  31
      3.5 IFN-γ氨基酸序列比对  31
    4. 讨论  31-33
  实验三 多浪羊IFN-γ基因原核表达载体的构建及表达  33-42
    1. 材料与方法  33-39
      1.1 材料  33-34
      1.2 方法  34-39
    2. 结果  39-41
      2.1 表达载体pET-28c(+)和pMD18T-IFN-γ的双酶切  39
      2.2 重组质粒pE-T-28c(+)-IFN-γ的PCR鉴定结果  39-40
      2.3 IFN-γ基因原核表达载体的双酶切鉴定  40
      2.4 IFN-γ表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳结果和应用软件BandScan5.0分析的蛋白含最结果  40-41
    3. 讨论  41-42
  实验四 多浪羊IFN-г重组蛋白的抗原性分析  42-48
    1. 试验材料和方法  42-46
      1.1 试验材料  42-43
      1.2 方法  43-46
    2. 结果  46-47
      2.1 抗血清的反应原性测定  46
      2.2 兔抗融合蛋白pET-28c-IFN-γ血清IgG的提取纯化  46-47
      2.3 重组蛋白pET-28c-IFN-γ的Western blotting分析  47
    3. 讨论  47
    4. 小结  47-48
结论  48-49
参考文献  49-52
附录  52-53
致谢  53-54
作者简介  54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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