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新疆卡拉库尔羊TNF-α基因的克隆、原核表达及抗原性分析

作　者: 贺艳艳
导　师: 李莲瑞
学　校: 塔里木大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: TNF-α 基因克隆 融合表达 抗原性
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


细胞因子TNF-α具有复杂的生物学活性,它是由巨噬细胞、单核细胞、多形核白细胞等多种细胞产生。近年来,对TNF基因的基础研究及应用研究已逐渐成为动物抗病育种的重要研究之一本试验以新疆卡拉库尔羊为研究对象,参照GenBank中收录的登录号为NM001024860的绵羊TNF-α基因序列设计一对特异性的引物。利用RT-PCR技术从卡拉库尔羊淋巴细胞总RNA中扩增出TNF-α基因序列,后将TNF-α目的基因与pMD-18T载体相连接,随后再转化到DH5α的感受态细菌中,获得阳性克隆后再将阳性克隆进行PCR及酶切鉴定,序列送交上海生物工程有限公司测序。结果表明：克隆得到的TNF-α序列有1268bp的碱基,包括705bp开放阅读框,编码234个氨基酸。TNF-α序列比较结果显示,与参考序列同源性高达99.86%。TNF结构域较为保守它与牛、海豚、野猪、人的同源性为92.47%、86.99%、87.1%、83.56%。TNF-α含有3个潜在的糖基化位点和12个磷酸化位点,序列中存在71个α螺旋,43个β片层结构区和120个无规则卷曲。TNF-α基因与pET-28b载体进行连接,酶切鉴定、PCR鉴定后确定含有目的基因片段的原核表达载体pET-28b-TNF-α构建成功。然后将重组的原核表达载体pET-28b-TNF-α转化到E.coliBL21中,用IPTG诱导表达,表达出约49KDa融合蛋白。同时根据SDS-PAGE显示对融合蛋白进行表达条件的优化,最佳诱导温度是37℃,最佳诱导时间为4.0h,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L.在优化条件后融合蛋白的表达含量通过Bandscan5.0软件分析,占菌体总蛋白的21.6%。pET-28b-TNF-α蛋白可溶性检测,结果显示原核表达质粒pET-28b-TNF-α表达的目的融合蛋白是以可溶的形式存在。用纯化的pET-28b-TNF-α免疫家兔,在免疫后的第45d,Western-blot和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28b-TNF-α能被家兔的阳性血清所识别,表达蛋白pET-28b-TN F-α具有较好的反应原性和免疫原性。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-11
第一章 文献综述  11-17
  1. 肿瘤坏死因子的发现和分布  11
  2. 肿瘤坏死因子结构  11-12
  3. 肿瘤坏死因子的生物学活性及应用  12-16
    3.1 TNF与肿瘤疾病  13-14
    3.2 TNF与病毒性肝炎  14
    3.3 TNF与细菌感染性疾病  14
    3.4 TNF与寄生虫病  14-15
    3.5 TNF与糖尿病、肝病、肥胖症  15
    3.6 TNF与心血管疾病  15-16
  4. 试验的目的及意义  16-17
第二章 研究内容  17-53
  实验一 卡拉库尔羊TNF-α基因的克隆及序列特征性分析  17-35
    1. 试验材料与方法  17-25
      1.1 试验材料  17-19
      1.2 试验方法  19-25
    2. 结果  25-32
      2.1 卡拉库尔羊淋巴细胞分离  25
      2.2 卡拉库尔羊淋巴细胞总RNA完整性的鉴定  25-26
      2.3 卡拉库尔羊TNF-α基因的PCR扩增  26
      2.4 卡拉库尔羊TNF-α-pMD-18T基因的菌液PCR及酶切鉴定  26-27
      2.5 卡拉库尔羊TNF-α基因的序列分析  27-32
    3. 讨论  32-34
      3.1 淋巴细胞分离  32-33
      3.2 RNA提取  33
      3.3 TNF-α基因的克隆  33
      3.4 TNF-α序列分析  33-34
    4. 小结  34-35
  实验二 卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达  35-45
    1. 试验材料和方法  35-41
      1.1 试验材料  35-37
      1.2 试验方法  37-41
    2. 结果  41-44
      2.1 卡拉库尔羊TNF-α基因重组原核表达质粒的鉴定  41
      2.2 重组质粒pET-28b-TNF-α诱导表达条件优  41-44
    3. 讨论  44
    4. 小结  44-45
  实验三 卡拉库尔羊TNF-α重组蛋白的纯化及抗原性分析  45-53
    1. 试验材料和方法  45-49
      1.1 试验材料  45-46
      1.2 方法  46-49
    2. 结果  49-52
      2.1 表达产物的定性分析  49-50
      2.2 重组蛋白pET-28b-TNF-α的纯化  50
      2.3 抗血清的免疫原性测定  50-51
      2.4 兔抗融合蛋白pET-28b-TNF-α血清IgG的提取纯化  51
      2.5 重组蛋白pET-28b-TNF-α的Western Blotting分析  51-52
    3. 讨论  52
      3.1 融合蛋白的可溶性分析  52
      3.2 融合蛋白的抗原性分析  52
    4. 小结  52-53
第三章 结论  53-54
参考文献  54-59
附录  59-60
致谢  60-61
作者简介  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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