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转基因饲料中bar基因检测方法的研究

作　者: 李风翠
导　师: 张书霞; 林祥梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 饲料 Bar基因 PAT蛋白 TaqMam荧光定量PCR 抗原表位免疫胶体金层析试纸条
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

从Streptomyces hygroscopicus(?)吸水链霉菌)中分离得到的bialaphos resistance gene(Bar基因)被证明具有良好的抗除草剂效果,用转基因育种的方法将Bar基因导入到作物中培育了抗除草剂的转基因作物(如棉花、玉米等),随着抗除草剂转基因作物种植面积的增加,且越来越多地应用到动物饲料中,Bar基因可能间接地随着动物性产品进入人类食物链,由于转Bar基因饲料的安全性问题目前仍不明确,急需对转Bar基因饲料进行检测并标识,保护使用者对转Bar基因饲料的知情权。本研究即以检测饲料中是否含转Bar基因为目的,分别从基因和蛋白水平建立快速便捷的检测方法。1、检测饲料中转Bar基因实时荧光定量PCR方法的研究。根据NCBI中已发表的Bar基因序列设计引物和探针,通过对试验条件的优化和对人工模拟混合饲料样品的检测,建立了能检测转Bar基因成分为0.5%的饲料样品,说明本试验建立的实时荧光定量PCR方法适用于对转Bar基因饲料的检测。2、检测饲料中转Bar基因产物PAT蛋白的免疫胶体金层析试纸条方法的建立。Bar基因编码的膦化麦黄酮乙酰转移酶(PAT),能分解除草剂中的有效成分草丁膦(PPT),起到抗除草剂的作用。用DNAStar生物学分析软件对Bar基因编码PAT蛋白的氨基酸序列进行分析,预测其潜在的抗原表位,并合成了六条潜在抗原表位多肽,通过免疫Balb/c小鼠获得抗体,筛选出具有抗原表位的多肽,得到编码抗原表位的基因片段。通过编码柔性氨基酸的DNA序列将基因片段连接,重组Bar基因,并加入BamHI、XhoI酶切位点。将重组Bar基因与原核表达载体pGEX-6P-1连接,构建重组质粒pGEX-6P-1-CBG544.经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,将重组质粒pGEX-6P-1-CBG544转化大肠杆菌表达,经IPTG诱导,表达产物主要以包涵体的形式存在,蛋白相对分子量约为46kD,将包涵体离心、洗涤和亲和层析纯化,获得了高纯度重组蛋白pGEX-6P-1-PAT。用重组的pGEX-6P-1-PAT蛋白免疫日本大耳白兔获得的抗体,经纯化、鉴定,得到了纯度较高的抗重组PAT蛋白的抗体。用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒并标记抗重组PAT蛋白的抗体,获得金标抗体,将其包被在玻璃纤维上,并将抗体(检测线)和羊抗兔IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上,按顺序组装胶体金快速检测试纸条。以人工模拟混合饲料样品作为检测对象,并与检测PAT蛋白的ELISA试剂盒进行比较。结果证实胶体金试纸条可检出含1%的转Bar基因人工模拟动物饲料。检测快速、简便,适用于对转Bar基因饲料进行现场筛选和检测。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
中英文縮略词表  10-12
前言  12-13
第一篇文献综述  13-27
  第一章转基因植物性饲料研究进展  13-27
    1 转基因植物性饲料的发展现状  13-14
    2 转bar基因的抗除草剂作物发展现状  14-15
    3 转基因植物性饲料的生物安全  15-16
    4 针对植物性转基因饲料的常用检测方法  16-20
    5 研究的目的和意义  20-22
    参考文献  22-27
第二篇试验研究  27-67
  第二章转基因词料中基因焚光定量PCR方法的研究  27-37
    摘要  27
    ABSTRACT  27-28
    1 材料和方法  28-30
    2 结果与分析  30-32
    3 讨论  32-34
    参考文献  34-37
  第三章多表位重组PAT蛋白的表达及抗体制备  37-55
    摘要  37
    ABSTRACT  37-38
    1 材料和方法  38-46
    2 结果与分析  46-51
    3 讨论  51-54
    参考文献  54-55
  第四章检测PAT蛋白免疫胶体金层析试纸条的研究  55-67
    摘要  55
    ABSTRACT  55-56
    1 材料和方法  56-60
    2 结果与分析  60-62
    3 讨论  62-65
    参考文献  65-67
全文结论  67-69
  1、建立了检测转基因饲料中bar基因的实时荧光定量PCR方法  67
  2、获得了bar基因的多表位重组蛋白及抗体  67
  3、建立了检测转基因饲料中bar基因的免疫胶体金层析试纸条方法  67-69
致谢  69-71
附录  71-74

转基因饲料中bar基因检测方法的研究

内容摘要

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