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应用MBD1检测全基因组DNA甲基化方法的建立及鸡FTO蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体制备

作　者: 张春晓
导　师: 赵茹茜
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 全基因组DNA甲基化甲基化CpG结合蛋白狭缝转印 FTO 原核表达多克隆抗体制备
分类号: S852.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

DNA甲基化是哺乳动物最重要的表观遗传学修饰之一。全基因组DNA甲基化水平的改变与胚胎发育、癌症发生等生理或病理过程密切相关。现有的甲基化水平检测方法都存在一定的缺陷,如DNA甲基容受性测定法灵敏性较低；高效液相色谱法操作繁琐,过程复杂；焦磷酸测序只能针对已知序列的特定片段进行检测。此外,许多方法只有在将DNA变性为单链后才可进行。甲基化CpG结合蛋白家族（methyl-CpG binding domain protein, MBD）中的MBD1, MBD2, MBD3, MBD4和MeCP2可以特异性识别天然双链DNA的甲基化。本试验应用MBD1重组蛋白建立一种可以快速、简便地检测全基因组DNA甲基化水平的半定量方法。1MBD1检测全基因组DNA甲基化水平的方法的建立首先通过细菌原核表达得到MBD1重组蛋白：将重组质粒pET30b+-MBD1转化到大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,柱上复性后洗脱。纯化效果通过SDS-PAGE鉴定。采用MBD1检测全基因组DNA甲基化水平方法流程大致如下：将DNA经狭缝转印至硝酸纤维素膜上,用MBD1孵育,再与HisProbe-HRP反应,最后采用ECL化学发光试剂盒检测。方法的特异性检验：将经过或不经过体外甲基化处理的细菌Lambda DNA按照不同比例混合,建立甲基化程度从0-100%的标准曲线,甲基化Lambda DNA显示阳性条带,未甲基化的Lambda DNA不显示条带,条带亮度与甲基化程度的线性回归分析证明该方法可以定量地检测甲基化DNA。最后通过加入不同量的鸡腿肌的基因组DNA检测此方法的灵敏性,结果显示该方法最低可以检测0.5μg的基因组DNA。2MBD1检测全基因组DNA甲基化水平方法的应用与评价运用该方法检测中国猪种（二花脸猪）和外国猪种（长白猪）的DNA甲基化的组织特异性和品种特异性,检测发现肌肉的全基因组DNA甲基化程度最高,三种被检组织基因组DNA甲基化水平二花脸猪均高于大白猪,且在肝脏中差异显著（P=0.034）；母体蛋白限饲对梅山猪子代肝脏全基因组DNA甲基化没有显著的影响。此外应用该方法检测了温氏黄羽肉鸡DNA甲基化的组织差异及发育变化（18胚龄和1日龄）,结果显示：与18胚龄相比,1日龄的温氏黄羽肉鸡肝脏、肾、小肠和腿肌四种组织基因组DNA甲基化水平都呈下降趋势,其中肾的全基因组DNA甲基化水平显著下降（P=0.05）。18胚龄时,肾的DNA甲基化水平显著高于肝脏。最后,应用商品化的5甲基胞嘧啶抗体检测1日龄鸡DNA甲基化水平的组织差异,验证了本试验所建立方法的准确性。3鸡FTO蛋白原核表达、纯化与多克隆抗体制备全基因组关联分析证明FTO基因（fat mass and obesity-associated gene）在不同人群中与肥胖和能量代谢密切相关。本试验室的研究表明,FTO基因在鸡的下丘脑、肝脏、内脏脂肪和小脑均有较高的表达。但是由于缺乏禽类特异性的FTO抗体,对鸡FTO蛋白的功能研究受到阻碍。本部分试验旨在制备鸡FTO的多克隆抗体。首先以鸡的FTO基因序列（NM₀01185147）设计引物,扩增得到的产物经测序验证后插入表达质粒pColdI,得到重组表达质粒pColdI-FTO;将pColdI-FTO转化到大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB培养基中,IPTG诱导蛋白表达,得到鸡的FTO重组蛋白,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,洗脱后通过SDS-PAGE鉴定。以纯化后的鸡FTO重组蛋白为抗原,免疫新西兰白兔制备多抗血清。ELISA检测所得抗血清效价为1：51200,Western blot鉴定其具有良好的特异性。使用所得到的鸡FTO蛋白多克隆抗体,对白羽肉鸡的下丘脑、肾脏、肝脏、腿肌、脾和卵巢的组织蛋白进行Western blot分析,60kD左右的位置均检测出条带,与预期一致。此外,在42kD、33kD和27kD左右的位置也观察到条带,分别代表几种不同分子量的FTO蛋白异构体,并且这些异构体的分布模式可能存在组织特异性,其功能意义有待进一步分析。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略语  12-13
引言  13-14
第一篇文献综述  14-30
  第一章 DNA甲基化及检测方法  14-27
    1 DNA甲基化概述  14-16
      1.1 DNA甲基化  14-15
      1.2 DNA甲基化动态变化与胚胎发育  15
      1.3 DNA甲基化异常与肿瘤  15-16
    2 全基因组DNA甲基化水平检测方法  16-19
      2.1 高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)  16-17
      2.2 高效毛细管电泳（high-performance Capillary electrophoretc, HPCE)  17-18
      2.3 薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)  18
      2.4 酶或化学分析方法  18-19
      2.5 免疫化学法  19
    3 特定位点DNA甲基化检测方法  19-22
      3.1 基于亚硫酸盐转化的方法  19-21
      3.2 基于甲基化敏感的限制性内切酶的方法  21
      3.3 测序技术  21-22
    4 MBD蛋白与DNA甲基化检测  22-27
      4.1 MBD与MBD蛋白的发现  22-23
      4.2 MBD蛋白家族成员简介  23-24
      4.3 利用MBD蛋白检测DNA甲基化的方法  24-27
  第二章 FTO研究进展  27-30
    1 FTO基因与FTO蛋白  27-29
      1.1 FTO基因的结构与特性  27
      1.2 FTO蛋白的结构与可能的功能  27-29
    2 禽类FTO的研究  29
    3 重组蛋白原核表达系统  29-30
第二篇试验研究  30-62
  第三章 MBD1重组蛋白检测全基因组DNA甲基化水平方法的建立  30-40
    1 材料与方法  30-35
      1.1 载体、菌株  30
      1.2 主要试剂和仪器  30-31
      1.3 主要溶液  31-32
      1.4 Lambda DNA的甲基化  32
      1.5 MBD1重组蛋白的表达、复性与纯化  32-34
      1.6 狭缝转印分析  34-35
    2 结果与分析  35-39
      2.1 MBD1重组蛋白提纯鉴定  35-36
      2.2 标准曲线  36-37
      2.3 饱和曲线  37-39
    3 讨论  39-40
  第四章检测方法的应用与评价  40-45
    1 材料与方法  40-41
      1.1 载体、菌株  40
      1.2 主要试剂和仪器  40
      1.3 主要溶液  40
      1.4 基因组DNA的提取  40-41
      1.5 MBD1重组蛋白的表达、复性与纯化  41
      1.6 狭缝转印分析  41
    2 结果与分析  41-44
      2.1 猪全基因组DNA甲基化程度的组织、品种差异  41-42
      2.2 母体蛋白限饲对子代梅山猪肝脏甲基化水平的影响  42
      2.3 鸡全基因组DNA甲基化程度的组织特异性与发育变化  42
      2.4 检验方法的准确性验证  42-44
    3 讨论  44-45
  第五章 FTO蛋白原核表达及多克隆抗体制备  45-62
    1 材料与方法  45-55
      1.1 载体、菌株及实验动物  45
      1.2 主要试剂和仪器  45-48
      1.3 pColdI-FTO质粒构建  48-52
      1.4 FTO重组蛋白的表达  52
      1.5 FTO重组蛋白纯化  52-53
      1.6 FTO多克隆抗体制备  53-55
    2 结果与分析  55-60
      2.1 pColdI-FTO质粒构建  55-56
      2.2 FTO重组蛋白的表达  56
      2.3 FTO重组蛋白表达条件的优化与纯化  56-57
      2.4 抗体效价与特异性检测  57-58
      2.5 鸡FTO蛋白组织特异性检测  58-60
    3 讨论  60-62
全文总结  62-64
参考文献  64-72
致谢  72

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