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油桐种仁不同发育时期表达蛋白质组学研究

作　者: 占志勇
导　师: 周志春
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 林木遗传育种
关键词: 油桐油体表达蛋白质组学双向电泳质谱
分类号: S794.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

油桐是原产我国的世界著名木本油料树种，从其种子中提炼而出的桐油是一种性质优良的干性油，广泛应用于工业中，具有极高的出口价值。利用经典蛋白质组学研究方法成功构建出油桐种仁在这一发育过程中的蛋白质表达谱，最终可运用蛋白质表达谱从蛋白质水平对油桐种仁中脂肪酸代谢过程进行阐述。发现油桐种仁中油脂含量与参与脂肪酸代谢的蛋白表达情况密切相关，油脂含量是由一系列参与脂肪酸代谢的蛋白（酶）共同决定的；此外，油体的动态发育过程更加形象化的体现了这一过程。论文为构建油桐种仁蛋白质表达谱从蛋白质水平理解其内油脂合成过程，对种仁蛋白质的提取、双向电泳体系优化、表达谱分析做了大量研究，得出研究结论如下：（1）分析了影响油桐种仁蛋白质提纯的关键因素，筛选确定TCA-丙酮结合酚抽法为有效提取油桐种仁蛋白质。实验结果表明种仁中的内含物对油桐种仁蛋白质提纯影响显著，采用TCA-丙酮结合酚抽法能针对油桐种仁中所富含的次生代谢物质如核酸、糖、酚类物质进行有效清除，故能制备出浓度高达8.1μg/μL的蛋白质样品；其次，SDS-PAGE实验表明，TCA-丙酮结合酚抽法对种仁中的高、低分子量蛋白质有较强的提取能力；再次， TCA-丙酮结合酚抽法所制备的蛋白质样品2-DE图谱分辨率高、背景清晰。（2）成功构建出具有高稳定性和高重复性的油桐种仁蛋白质双向电泳体系。具体针对能影响油桐种仁蛋白质双向电泳效果的蛋白质裂解液、上样量、等电聚焦时间以及SDS-PAGE电泳的运行条件等因素，进行优化对比实验，确定了各因素的最优条件。成功构建的最优油桐种仁蛋白质双向电泳体系为：以TCA-丙酮结合酚抽法制备样品后经过配方为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/L DTT和2%IPG buffer的裂解液裂解后，等电聚焦上样700μg进行聚焦70000Vh能够得到良好的分离效果。（3）研究发现油桐在花后130d~160d为其发育过程中油脂积累的关键时期。通过对油脂含量变化和种壳颜色变化将这一时期划分为3个不同的发育阶段S1（130d）、S2（145d）和S3（160d）。（4）在油桐种仁发育的3个不同阶段中共发现有144个蛋白质发生了差异表达，并通过MALDI-TOF/MS/MS成功鉴定出其中76个，将其分为能量代谢（25%）、脂肪酸代谢（15.79%）、抗性（14.47%）、蛋白酶（11.84%）等11个功能类别。（5）研究发现能量代谢一直是油桐种仁发育过程中除了脂肪酸代谢之外的最主要的生理代谢活动之一，TAC循环和糖酵解是其主要的代谢途径。S29（Malate dehydrogenase，苹果酸脱氢酶）的表达量随着种仁发育而逐渐增加，表明TAC循环中的草酰乙酸再生速度得到提升，而草酰乙酸的再生过程是维持TAC循环持续进行的关键。S62（3-phosphoglycerate kinase，3-磷酸甘油酸激酶）表达随着种仁发育而增加表明糖酵解代谢随着发育而得到增强。研究发现多数参与脂肪酸代谢的蛋白质在3个时期中的表达变化过程与种仁中油脂的积累速率变化相一致，均是抛物线的变化趋势，峰值出现在S2时期。这一发现有助于成功从蛋白质水平对种仁中油脂积累变化进行阐述。RT-PCR对参与能量代谢、脂肪酸代谢的10个蛋白质的研究结果表明，基因水平上的表达变化趋势与蛋白质水平的表达变化趋势具有较高的相似性，表明质谱鉴定结果具有较高的可靠性；同时，RT-PCR结果也可得出上述（5）（6）的结论。（6）在不同的发育阶段，油体有不同的细胞学特征。以此为基础可以将其发育过程分为发育初期、中期以及后期三个阶段。研究发现油体的数量与油脂含量表现出负相关关系；而油体大小与油脂含量则为正相关关系。油体动态发育过程与油桐种仁中脂肪酸积累、脂肪酸代谢相关蛋白表达变化具有密切联系。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
表目录  12-13
图目录  13-15
第一章绪论  15-44
  1.1 油桐研究现状  15-28
    1.1.1 油桐资源及其利用  15-21
    1.1.2 油桐研究现状  21-28
  1.2 植物蛋白质组学研究  28-42
    1.2.1 国内外植物蛋白质组学研究现状  28-33
    1.2.2 植物蛋白质组学主要研究技术  33-42
  1.3 研究目的与意义  42-43
  1.4 本研究的技术路线  43-44
第二章油桐种仁蛋白质组提取方法比较研究  44-62
  2.1 材料与方法  44-55
    2.1.1 仪器、试剂及其配制  44-49
    2.1.2 实验方法  49-55
  2.2 结果与分析  55-59
    2.2.1 三种蛋白质提取方法的提取效率比较  55-57
    2.2.2 三种蛋白质提取方法所得样品 SDS-PAGE 电泳  57-58
    2.2.3 三种不同蛋白质提取方法所得样品 2-DE 电泳  58-59
  2.3 讨论  59-61
  2.4 本章小结  61-62
第三章油桐种仁蛋白质双向电泳体系的建立  62-76
  3.1 材料与方法  62-64
    3.1.1 仪器、试剂及其配制  62-63
    3.1.2 实验方法  63-64
  3.2 结果与分析  64-71
    3.2.1 裂解液配方的优化选择  64-65
    3.2.2 IEF 上样量的优化  65-67
    3.2.3 等电聚焦程度的优化确定  67-68
    3.2.4 SDS-PAGE 运行条件的优化  68-70
    3.2.5 油桐种仁蛋白质组完整双向电泳体系  70-71
  3.3 讨论  71-75
    3.3.1 蛋白质样品浓度的高低对 2-DE 的影响  71-72
    3.3.2 蛋白质点分离较少对 2-DE 的影响  72-73
    3.3.3 2-DE 图谱中横、纵条纹较多  73-74
    3.3.4 2-DE 图谱中出现蛋白聚集沉淀  74
    3.3.5 其他  74-75
  3.4 本章小结  75-76
第四章不同发育时期油桐种仁蛋白质表达谱的构建  76-112
  4.1 材料与方法  77-84
    4.1.1 实验仪器及所需试剂配制  77-79
    4.1.2 实验方法  79-84
  4.2 结果与分析  84-100
    4.2.1 油桐种仁发育过程及各时期油脂含量变化  84-86
    4.2.2 油桐种仁蛋白质各发育时期的 2-DE 图谱比较  86-89
    4.2.3 油桐种仁在不同发育阶段的差异蛋白质  89-91
    4.2.4 差异蛋白质点质谱鉴定结果  91-97
    4.2.5 RT-PCR 引物有效性  97-98
    4.2.6 RT-PCR 分析脂肪酸代谢变化  98-100
  4.3 讨论  100-110
    4.3.1 油桐种仁发育过程蛋白质表达变化分析  100-102
    4.3.2 各功能类别蛋白质在发育过程中的表达变化分析  102-105
    4.3.3 发育过程中某些特异蛋白的表达变化及功能分析  105-108
    4.3.4 油桐种仁发育过程营养物质积累相关蛋白表达变化分析  108-109
    4.3.5 一些未被鉴定出的蛋白质  109-110
  4.4 本章小结  110-112
第五章油桐种仁油体动态发育与蛋白质表达谱关联性分析  112-124
  5.1 材料与方法  113-114
    5.1.1 实验仪器和试剂  113-114
    5.1.2 实验方法  114
  5.2 结果与分析  114-120
    5.2.1 各时期油桐种仁胚乳细胞中油体分布  114-116
    5.2.2 各时期油桐种仁胚乳细胞中油体数量分析  116-118
    5.2.3 各时期油桐种仁胚乳细胞中油体大小分析  118-120
  5.3 讨论  120-122
    5.3.1 油桐胚乳细胞在油体动态发育过程中的细胞学特征变化  120-121
    5.3.2 油桐油体动态发育过程与脂肪酸积累过程的关联性分析  121
    5.3.3 油桐油体动态发育过程与相关蛋白表达变化过程的关联性分析  121-122
  5.4 本章小结  122-124
第六章主要结论和展望  124-127
  6.1 主要结论  124-126
    6.1.1 油桐种仁不同发育时期蛋白质组学研究  124-125
    6.1.2 油体动态发育与油桐蛋白质表达谱的关联性  125-126
  6.2 展望  126-127
参考文献  127-146
附录  146-148
在读期间的学术研究  148-149
致谢  149

油桐种仁不同发育时期表达蛋白质组学研究

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