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柽柳真核起始因子5A（e1F5A）基因的功能研究
作 者: 王留强
导 师: 王玉成
学 校: 东北林业大学
专 业: 林木遗传育种
关键词: eIF5A 柽柳 酵母双杂交 酵母单杂交 非生物胁迫响应 蛋白质合成
分类号: S793.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
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在植物生长和发育的过程中,不断遭受各种各样的外界环境因素的影响,例如,受到干旱、重金属和高盐等。为了在多种的逆境下正常生长,它们在分子、细胞以及系统水平上进化出各种复杂而深奥的网络信号。真核生物翻译起始因子5A能促进蛋白翻译起始阶段第一个肽键的形成。然而,其具体的生物学功能尚不清楚。已有研究表明,eIF5A参与植物细胞的多种生物学过程。本研究通过对柽柳(Tamarix androssowii) eIF5A基因(TaeIF5A1)进行了深入的功能研究和抗逆性机制探讨。主要结果如下：通过实时定量RT-PCR技术研究TaeIF5A1基因在多种非生物胁迫下的表达模式,结果表明该基因能响应各种盐胁迫,并且可能参与ABA信号通路的调控。为了研究TaeIFSA1基因的时空表达特异性,用TaeIFSA1启动子替换载体pCAMBIA1301上35S启动子驱动GUS基因。通过对转基因ProTaeIF5A1::GUS拟南芥的GUS染色,结果显示TaeIF5Al主要在主根、叶齿尖、叶脉和花中表达。TaeIF5A1基因的启动子中有w-box,将该序列以3次重复的形式构建到报告载体pHIS2中,利用酵母单杂交技术,我们筛选到两个cDNAs分别编码WRKY transcription factor (TaWRKY)和AP2/ERF and B3domain-containing transcription factor (TaRAV)。首先,将W-box的核心序列"TGAC"突变成"TGGC","TAAC"或"TTTT",发现两个转录因子都不与其特异性结合。同时,它们都能与包含W-box的165bp和461bp的TaeIF5A1启动子片段特异性的结合,但不能和含有突变W-box的165bp启动子片段结合。RT-PCR分析显示TaeIF5A1、TaRAV和TaWRKY在响应ABA和高渗胁迫处理下的表达模式一致。利用酵母双杂交技术分析了柽柳TaeIF5A1和其他TaeIF蛋白之间的互作,结果表明TaeIF5A1能与TaeIF5A4形成异源二聚体复合物。TaeIF5A1的表达促进了转基因酵母INVScl (pYES2-TaeIF5Al)的蛋白质的合成,进而增强了转基因的抗盐能力。
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全文目录
摘要 3-4
Abstract 4-9
1 绪论 9-14
1.1 引言 9
1.2 真核起始因子5A 9-11
1.2.1 真核起始因子5A的概述 9
1.2.2 真核起始因子5A的研究现状 9-10
1.2.3 植物中真核起始因子5A的研究进展 10-11
1.3 柽柳的介绍及研究意义 11-13
1.3.1 柽柳的介绍 11-12
1.3.2 柽柳的胁迫抗性研究的意义 12-13
1.4 前期研究 13-14
2 柽柳TaelF5A1表达模式及其启动子分析 14-22
2.1 实验材料 14-15
2.1.1 植物材料 14
2.1.2 菌种与载体 14
2.1.3 主要试剂 14
2.1.4 溶液配制 14-15
2.2 实验方法 15-17
2.2.1 RNA的提取,纯化和反转录 15-16
2.2.2 实时定量PCR 16
2.2.3 TaelF5A1启动子序列分析 16
2.2.4 TaelF5A1启动子的表达特性分析 16-17
2.3 结果与分析 17-20
2.3.1 TaelF5A1基因在不同胁迫下的表达模式 17-18
2.3.2 TaelF5A1启动子序列分析 18-19
2.3.3 TaelF5A1基因的时空表达特性 19-20
2.4 讨论 20-21
2.4.1 TaelF5A1参与不同非生物胁迫的应答 20-21
2.4.2 TaelF5A1基因的时空表达特性 21
2.5 本章小结 21-22
3 柽柳TaelF5A1互作蛋白的研究 22-30
3.1 实验材料 22-23
3.1.1 植物材料 22
3.1.2 菌株和载体 22
3.1.3 主要试剂 22
3.1.4 主要培养基 22-23
3.1.5 溶液配制 23
3.2 实验方法 23-27
3.2.1 TaelF5A1同源基因的鉴定和序列分析 23
3.2.2 Bait载体的构建 23-25
3.2.3 Prey载体的构建 25-26
3.2.4 Bait和Prey载体的互作验证 26-27
3.3 结果与分析 27-29
3.3.1 TaelF5A1同源基因的序列分析 27-28
3.3.2 TaelF5A1与其它TaelF的互作确认 28-29
3.4 讨论 29
3.5 本章小结 29-30
4 柽柳TaelF5A1上游表达调控基因研究 30-45
4.1 实验材料 30-31
4.1.1 植物材料 30
4.1.2 菌株和载体 30
4.1.3 主要试剂 30
4.1.4 主要培养基 30
4.1.5 溶液配制 30-31
4.2 实验方法 31-39
4.2.1 构建pHIS2-靶DNA重组报告载体 31-33
4.2.2 TaelF5A1基因上游调控因子的确定 33-34
4.2.3 基因枪瞬时转化烟草验证TaWRKY和TaRAV与W-box元件结合 34-38
4.2.4 TaWRKY和TaRAV的表达模式分析 38-39
4.3 结果与分析 39-43
4.3.1 pHIS2-靶DNA报告载体的获得 39
4.3.2 TaWRKY和TaRAV能识别TaelF5A1基因的启动子区 39-41
4.3.3 上游调控因子与作用元件在烟草中的互作验证 41-42
4.3.4 TaWRKY和TaRAV表达模式分析 42-43
4.4 讨论 43-44
4.4.1 TaRAV和TaWRKY能与W-box“CTGACT”特异性结合 43-44
4.4.2 TaWRKY和TaRAV调控TaelF5A1基因的表达 44
4.5 本章小结 44-45
5 柽柳TaelF5A1基因在酵母中的抗逆能力分析 45-50
5.1 实验材料 45
5.1.1 菌株和载体 45
5.1.2 主要试剂 45
5.1.3 主要培养基 45
5.2 实验方法 45-47
5.2.1 重组酵母INVSc1(pYES2-TaelF5A1)对逆境胁迫的抗性分析 45-46
5.2.2 重组酵母INVSc1(pYES2-TaelF5A1)蛋白含量测定 46-47
5.3 结果与分析 47-49
5.3.1 重组酵母INVSc1(pYES2-TaelF5A1)抗性功能分析 47-48
5.3.2 重组酵母INVSc1(pYES2-TaelF5A1)的蛋白合成分析 48-49
5.4 讨论 49
5.5 本章小结 49-50
结论 50-51
参考文献 51-55
附录 55-56
攻读学位期间发表的学术论文 56-57
致谢 57-58
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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶灌木 > 柽柳
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