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人类心脏发育候选基因AHNAKβ的表达与功能研究

作　者: 李宁
导　师: 李永青；吴秀山
学　校: 湖南师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 心脏发育 AHNAKβ TNNI3 酵母双杂交免疫共沉淀
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

心脏发育过程是一个错综复杂的过程,其发育过程是由一系列的基因参与完成的。虽然目前已经鉴定出很多心脏发育相关的基因,但是仍有很多心脏发育相关基因有待鉴定。本文作者为了研究与心脏发育和心脏疾病相关的基因,利用生物信息学分析,从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个心脏发育候选基因AHNAKβ。AHNAKβ（登录号NM₀24060）位于11q12.2,长1108bp,由6个外显子和5个内含子组成,其中开放阅读框（ORF）长450bp （301-750 nt）,编码含有149个氨基酸,蛋白质大小约为16.0KD。它是AHNAK的第二个转录剪接体。第一个转录剪接体AHNAKa的cDNA为18815个碱基,编码一个680KD的巨型蛋白。通过BLAST比对,我们发现AHNAKα与AHNAKβ的N端是一样的,但是AHNAKβ的C端与a完全不一样。因为已知AHNAKα具有控制心肌收缩的作用,提示AHNAKβ可能与心脏发育相关。为了研究AHNAKβ基因的蛋白表达模式,我们首先制备该基因的多克隆抗体。我们利用制备的多克隆抗体研究该基因在蛋白水平的表达模式。组织Western blot结果表明,该基因在小鼠成体中心脏和肠的表达最强,其次在子宫的表达较强,在脾脏和肾有微弱的表达。为了更好的研究这个基因在心脏发育过程中的时空表达模式,我们进一步利用小鼠不同发育阶段的胚胎材料,通过胚胎原位杂交和免疫组化分析该基因的时空表达模式。首先选择AHNAKβ的C端的特异碱基序列作为探针。胚胎原位杂交结果表明,该基因在小鼠胚胎中的心脏组织表达最强,在肌肉和脑的表达较强。其次利用抗体进行免疫组化分析,研究结果表明,AHNAKβ蛋白在心脏,肌肉和脑中表达,其中以心脏和脑表达最为强烈。我们进一步利用新生小鼠原代心肌细胞检测AHNAKβ蛋白在细胞中的分布状况。免疫荧光实验检测结果表明AHNAKβ蛋白定位于心肌细胞细胞质中。进一步利用免疫电镜技术观察表明,该基因在心肌细胞中的肌丝和线粒体上大量表达。为了研究AHNAKβ相互作用蛋白,我们通过酵母双杂交技术,从成人心脏文库中筛选并鉴定到8个与AHNAKβ发生相互作用的蛋白质,其中TNNI3是一个与心脏特异性表达的基因,它与家族性肥厚型心肌炎的发生有着密切的关系。为了进一步证明AHNAKβ和TNNI3是否发生相互作用,我们通过免疫共沉淀实验进行验证,结果证明AHNAKβ和TNNI3在体内确实存在相互作用。上述结果表明AHNAKβ在小鼠心脏的各个发育阶段中表达,提示它在心脏发育过程中可能起着一个重要的作用。这为以后深入地研究人类AHNAKβ在心脏方面的功能打下了良好的基础。

人类心脏发育候选基因AHNAKβ的表达与功能研究

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