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小黑杨碳酸酐酶家庭基因的研究

作　者: 钱婷婷
导　师: 魏志刚
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 小黑杨碳酸酐酶基因克隆生物信息学实时荧光定量PCR
分类号: S792.119
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,简称CA),是一种含锌金属酶,它催化CO2和H2O变为HC03-和H+的反应。它广泛存在于植物中,在高等植物光合作用固碳过程中扮演着重要的角色。因此,克隆和分析碳酸酐酶家族基因,可为通过基因工程提高植物光合作用、培育高效固碳植物新品种奠定基础。本文选取了小黑杨(Populus simonii×P. nigra)作为研究材料,克隆并分析了6个CA家族基因。并采用实时定量PCR技术研究了不同暗处理、不同部位这6个基因的表达量变化。主要的研究成果如下：1、从小黑杨中成功克隆了6个CA家族基因,分别命名为PsnCA1、PsnCA2、 PsnCA3、PsnCA4、PsnCA5和PsnCA6。其中,PsnCA1、PsnCA3和PsnCA5属于α碳酸酐酶家族,PsnCA4和PsnCA6属于β碳酸酐酶家族,PsnCA2属于LbeatH超家族。将它们与其它物种相关基因的氨基酸序列进行了多重比较,并绘制了分子进化树。对6个基因编码蛋白质的信号肽结构、疏水性、稳定性等性质进行了预测,并初步预测了其二级结构。2、定量PCR结果显示,6个基因的表达具有组织特异性。除了PsnCA6以外,其它基因均主要存在于叶中。其中PsnCA1在叶片组织中的表达量最为显著,是次表达量基因PsnCA3的1.7倍,是表达量最低基因PsnCA5的226倍。3、6个基因对暗处理的反应各异。将小黑杨组培苗分别进行6h、12h、24h和48h的暗处理。分别采集根、茎、叶进行实时荧光定量PCR反应。对6条基因定量PCR反应结果进行分析,结果显示：叶片组织中,随处理时间的增长PsnCA1的表达量呈显著降低趋势,其中暗处理48小时达到最低水平,是CK组表达量的0.005倍。PsnCA3表达量也有降低趋势,但是不如PsnCA1显著,48小时暗处理的表达量是CK组的0.14倍。其他基因的表达量无明显变化。在根茎中,各基因的表达量并无显著变化趋势。4、构建了带荧光标记的ps1300-CA1植物表达载体,为PsnCA1基因功能的分析奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 绪论  7-12
  1.1 引言  7
  1.2 碳酸酐酶概况  7-9
    1.2.1 碳酸酐酶的发现与分类  7-8
    1.2.2 碳酸酐酶催化的反应与原理  8
    1.2.3 碳酸酐酶在光合固碳中的主要功能  8
    1.2.4 高等植物中碳酸酐酶的研究进展  8-9
  1.3 实时荧光定量PCR概述  9-10
    1.3.1 实时荧光定量PCR技术原理  9-10
    1.3.2 实时荧光定量PCR的定量方法  10
    1.3.3 实时荧光定量PCR技术的应用  10
  1.4 本研究的目的和意义  10-12
2 小黑杨碳酸酐酶家族基因的克隆与分析  12-45
  2.1 材料与方法  12-13
    2.1.1 试验材料  12
    2.1.2 菌株与载体  12
    2.1.3 试剂与处理  12
    2.1.4 主要仪器设备  12-13
  2.2 实验方法  13-16
    2.2.1 小黑杨叶片总RNA提取  13
    2.2.2 cDNA的合成  13-14
    2.2.3 CA家族基因序列的分析  14
    2.2.4 克隆CA家族全长基因所需引物的设计  14
    2.2.5 RT-PCR合成目的基因片段  14
    2.2.6 PCR产物中DNA片段的回收和测序  14-16
    2.2.7 目的基因的序列分析  16
  2.3 结果与分析  16-44
    2.3.1 杨树数据库中CA家族基因的分析结果  16
    2.3.2 成功克隆的引物设计结果  16-17
    2.3.3 总RNA的提取  17
    2.3.4 全长序列的克隆与分析  17-44
  2.4 本章小结  44-45
3 不同光处理下小黑杨CA家族基因的荧光定量PCR分析  45-53
  3.1 实验材料  45
    3.1.1 植物材料  45
  3.2 实验方法  45-46
  3.3 结果与分析  46-51
    3.3.1 总RNA的提取  46-47
    3.3.2 实时定量PCR的可靠性  47
    3.3.3 实时定量PCR结果与分析  47-51
  3.4 讨论  51
  3.5 本章小结  51-53
4 PsnCA1基因植物表达载体的构建  53-57
  4.1 实验材料  53
    4.1.1 菌株和载体  53
    4.1.2 主要试剂  53
    4.1.3 主要仪器  53
  4.2 实验方法  53-55
    4.2.1 植物表达载体ps1300-CA1的构建  53-54
    4.2.2 重组质粒转化农杆菌  54-55
  4.3 结果与分析  55-56
  4.4 本章小结  56-57
结论  57-58
参考文献  58-62
附录  62-63
攻读学位期间发表的学术论文  63-64
致谢  64-65

小黑杨碳酸酐酶家庭基因的研究

内容摘要

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