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祁连山山生柳群体遗传多样性的SSR分析

作　者: 郭敏
导　师: 李毅
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 高寒地区山生柳不同海拔 SSR分子标记遗传多样性遗传距离聚类分析
分类号: S792.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本研究以高寒灌丛山生柳(Salix oritrepha)为研究材料,探讨在甘肃省山丹、肃南、青海、榆中、张掖、武威,青海省的化隆,四川省的康定。7个天然种群间及种群内的遗传多样性差异。并重点选择山生柳分布较为广泛的张掖市祁连山自然保护区西水生态站作为实验点,对山生柳不同海拔的遗传多样性做了细致的调查研究。本实验利用易于操作,可重复性高,共显性的SSR分子标记技术对不同山生柳种群的遗传多样性进行了研究,得出以下主要结论：1.采用L9(34)正交实验设计和单因子试验,研究了山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,通过反应体系的优化最终确立了适合山生柳的最优SSR反应体系和反应条件,结果表明山生柳PCR反应体系的最佳条件为：20μL体系中2.0mmol/L Mg2+1μL,0.10mmol/L浓度的dNTPsl.5μL,0.5U Taq酶用量为1μL,20ng/μLDNA模板1μL,0.5umol/L的上下游引物各2μL,10×Taq Buffer2μL, ddH2O加至20μL。扩增反应程序为：94℃高温预变性时间3min,94℃变性45s,Tm(不同退火温度)退火时间45s,72℃延伸30s,循环数30个,最后72℃后延伸时间5min,4℃保温。2.对祁连山脉7个不同天然种群共140个单株的山生柳遗传多样性和遗传结构进行了研究。结果显示,15条引物共检测到173条谱带,其中多态性条带有150条,平均每个引物检测到12个等位变异,多态位点比率(P)为89.02%。应用分析软件Popgen32进行分析得出：在物种水平上,Shannon多样性指数(Ⅰ)为0.6957,Nei基因多样性指数(H)为0.3859；基因分化系数Gst为0.0761,基因流Nm为6.0745,说明山生柳遗传分化大部分存在于相同种群内。7个种群的平均遗传距离为0.0638,其中SC与SN间的遗传距离最小,为0.0223。WW与ZY间的遗传距离最大,为0.1395。采用类平均法(UPGMA)对7个种群进行聚类绘图,大体分为3类群,SN(肃南)首先和SC(四川)相聚,再与SD(山丹),QH(青海),YZ(榆中)相聚为一类。与WW(武威)聚为第二类群,最后与ZY(张掖)聚为第三类群。这7个种群的多态性高低为：武威(WW)>张掖(ZY)>肃南(SN)>山丹(SD)>榆中(YZ)>四川(SC)>青海(QH)。3.通过对甘肃祁连山脉9个海拔梯度共180个单株的山生柳(Salix oritrepha)遗传多样性和遗传结构进行了研究。利用杨属植物的47对SSR引物对山生柳进行了通用性分析,筛选出15对重复性高、条带清晰的引物,结果显示,15条引物共检测到211条谱带,其中多态性条带有176条,平均每个引物检测到11个等位变异,多态位点比率(P)为85%。应用分析软件Popgen32进行分析得出：在物种水平上,Shannon多样性指数(I)为0.4192,Nei基因多样性指数(H)为0.2796；基因分化系数Gst为0.0935,基因流Nm为4.8487,说明山生柳遗传分化大部分存在于相同海拔梯度内。P、H、I都反应出山生柳具有较高的遗传多样性。聚类分析显示,遗传距离与空间地理距离有显著相关性。海拔及纬度因子显著影响山生柳种群的遗传多样性水平,海拔梯度越高,山生柳的遗传多样性越丰富。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-6
缩略词表  6-10
第一章前言  10-12
第二章文献综述  12-24
  1 柳属植物研究现状  12
  2 山生柳的研究现状  12-13
  3 山生柳概述  13-15
    3.1 山生柳的资源分布  13
    3.2 山生柳的生物学特征  13-14
    3.3 山生柳的研究区概况  14
    3.4 山生柳的栽培和利用现状  14-15
  4 遗传多样性研究概述  15-19
    4.1 柳属植物遗传多样性的研究  15
    4.2 遗传多样性研究方法及进展  15-16
      4.2.1 遗传多样性研究概述  15
      4.2.2 遗传多样性的主要研究方法  15-16
    4.3 分子标记  16-19
      4.3.1 形态标记方法检测遗传多样性  18
      4.3.2 细胞学标记检测遗传多样性  18
      4.3.3 生化（蛋白质）标记检测遗传多样性  18-19
  5 DNA 分子标记检测遗传多样性  19-23
    5.1 SSR 简单序列重复(Single Sequence Repeats)  20-21
    5.2 SSR 分子标记的类型  21
    5.3 SSR 分子标记的特点  21
    5.4 SSR 分子标记的应用  21-22
    5.5 SSR 引物的开发  22
    5.6 问题与展望  22-23
  6 目的意义及技术路线  23-24
    6.1 本研究的目的及意义  23
    6.2 研究目标和内容  23-24
    6.3 SSR 分子标记技术路线  24
第三章山生柳 SSR-PCR 反应体系的建立及不同种群遗传多样性的 SSR 分析  24-46
  1 材料与方法  24-26
  2 试剂与仪器  26-29
    2.1 主要试剂  26
    2.2 常用仪器及耗材  26
    2.3 凝胶电泳的配置及银染步骤  26-28
      2.3.1 凝胶溶液的配制  26-27
      2.3.2 银染步骤  27-28
    2.4 拍照并统计条带  28
    2.5 引物合成  28-29
  3 试验方法  29-33
    3.1 山生柳基因组 DNA 的提取  29-30
    3.2 DNA 纯度检测  30
    3.3 SSR-PCR 反应体系的建立  30-32
    3.4 数据统计分析  32-33
  4 结果分析  33-43
    4.1 山生柳基因组 DNA 检测分析  33-35
    4.2 山生柳 SSR-PCR 体系优化结果分析  35-38
      4.2.1 正交设计直观结果分析  35-36
      4.2.2 单因子试验结果分析  36-37
      4.2.3 反应程序的正交试验设计电泳结果  37
      4.2.4 不同退火温度的优化  37
      4.2.5 不同上样量对聚丙烯酰胺电泳结果的影响  37-38
    4.3 山生柳 SSR-PCR 扩增结果  38-40
      4.3.1 山生柳 SSR 扩增引物的筛选及种群的多态性  38-40
    4.4 山生柳的遗传多样性分析  40-43
      4.4.1 山生柳的遗传距离和遗传一致度  42
      4.4.2 山生柳的聚类分析  42-43
  5 讨论  43-46
    5.1 DNA 的提取  43
    5.2 SSR-PCR 反应体系的建立  43-44
    5.3 山生柳遗传多样性分析  44-45
    5.4 山生柳不同群体的遗传多样性  45-46
    5.5 山生柳不同群体的遗传分化  46
第四章山生柳不同海拔梯度遗传多样性的探究  46-59
  1 材料和方法  46-49
    1.1 取样方法和 SSR 引物来源  46-49
    1.2 PCR 扩增和成果检测  49
    1.3 数据统计和分析  49
  2. 结果和分析  49-53
    2.1 山生柳 SSR 扩增引物的筛选  49-50
    2.2 山生柳不同海拔梯度的遗传多样性分析  50-52
    2.3 山生柳不同海拔梯度的遗传距离和遗传一致度  52-53
    2.4 山生柳 9 个不同海拔的聚类分析  53
  3 讨论  53-59
    3.1 获取 SSR 引物的方法  53-54
    3.2 杨柳引物扩增的通用性  54
    3.3 山生柳不同海拔居群的遗传分化  54-56
    3.4 山生柳种质资源的保护  56-59
      3.4.1 遗传多样性的保护  56-57
      3.4.2 山生柳种群的遗传改良  57-59
参考文献  59-67
致谢  67-68
作者简介  68-69
导师简介  69

祁连山山生柳群体遗传多样性的SSR分析

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