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苏云金芽孢杆菌的筛选与伴孢晶体编码基因的克隆与序列分析

作　者: 李雪
导　师: 臧威
学　校: 齐齐哈尔大学
专　业: 遗传学
关键词: 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体基因型鉴定
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种自然界中广泛存在的微生物，其所产的具有杀虫活性的伴孢晶体是目前世界上生物杀虫剂的主要成分，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、线虫等200多种昆虫具有杀虫毒力。不同菌株产生编码的蛋白毒素不同，从而杀虫特性也不同，目前伴孢晶体的基因型分类已经达到cry70型。本文围绕对苏云金芽孢杆菌菌株的筛选，16S rRNA的鉴定，基因型的鉴定及全基因的克隆等方面进行一系列的研究。利用在中科院购买的菌株苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1752（基因型为cry1Ac）、苏云金芽孢杆菌以色列亚种CGMCC1.1754（基因型为cry4A，cry4B）作为对照菌株建立筛选方法和鉴定方法。利用已建立的方法，从药用植物园采集11种土样和清华大学的1种土样进行筛选，筛选得到一株产伴孢晶体的菌株，经基因型鉴定，结果显示基因型为cry8型基因；通过16S rRNA鉴定，鉴定结果显示为Bt菌株，命名为TS3。对TS3菌株进行生理生化实验，利用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1752（基因型为cry1Ac）、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1755（无质粒）做对照菌株，对上述三株菌进行API20E、API50CH、API ZYM实验，TS3菌株结果与对照菌株的生理生化特性绝大部分一致，可能由于是不同亚种，TS3会有微小差别。对TS3菌株的cry基因型进行克隆，克隆结果表明TS3所产伴孢晶体蛋白的基因型为cry8。基因全长3642bp，由1213个氨基酸组成，分子量为137kDa；并采用ProtScale、HNN方法和swiss-model程序对该蛋白进行模拟分析。对CGMCC1.1752进行发酵实验，主要针对碳源和氮源对伴孢晶体产量的影响，为TS3菌株的后续发酵优化培养奠定基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
1 前言  11-20
  1.1 苏云金芽孢杆菌毒素的分类和基因型的命名  12-13
    1.1.1 苏云金芽孢杆菌毒素的分类  12
    1.1.2 Bt 伴孢晶体编码基因的命名  12-13
    1.1.3 对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因  13
  1.2 伴孢晶体的蛋白结构和杀虫机理  13-16
    1.2.1 伴孢晶体的蛋白结构  13-14
    1.2.2 杀虫晶体蛋白的作用机理  14-16
  1.3 Bt 杀虫蛋白的应用  16-18
    1.3.1 野生菌株直接工业化生产  16-17
    1.3.2 构建工程菌株  17-18
    1.3.3 用于转基因植物中，抗病虫害  18
  1.4 本论文的研究目的及意义  18-20
2 产伴孢晶体的苏云金芽孢杆菌的菌株筛选  20-33
  2.1 材料与试剂  20-22
    2.1.1 对照菌株  20
    2.1.2 培养基  20-21
    2.1.3 仪器设备与试剂  21-22
  2.2 实验方法  22-27
    2.2.1 产伴孢晶体菌株的显微观察初选方法的建立  22-23
    2.2.2 cry 基因型鉴定复筛方法的建立  23-27
  2.3 结果与讨论  27-32
    2.3.1 CGMCC 1.1752 和 CGMCC 1.1754 菌株的显微镜观察  27-28
    2.3.2 CGMCC 1.1752 和 CGMCC 1.1754 菌株 cry 基因型鉴定  28-30
    2.3.3 伴胞晶体产生菌的筛选  30-31
    2.3.4 TS3 菌株的 cry 基因型的鉴定  31-32
  2.4 小结  32-33
3 伴胞晶体产生菌 TS3 的鉴定  33-47
  3.1 材料与试剂  33-34
    3.1.1 菌株与培养基  33
    3.1.2 引物与试剂  33-34
  3.2 生理生化实验原理  34-36
    3.2.1 API 20E 试剂盒  34-35
    3.2.2 API 50CH 试剂盒  35-36
    3.2.3 API ZYM 试剂盒  36
  3.3 实验方法  36-39
    3.3.1 菌株 16S rRNA 基因的系统发育分析  36-38
    3.3.2 生理生化方法  38-39
  3.4 结果与讨论  39-46
    3.4.1 16S rRNA 基因的系统发育分析  39-42
    3.4.2 生理生化实验结果与分析  42-46
  3.5 小结  46-47
4 TS3 菌株的 cry8 型全基因的克隆  47-60
  4.1 材料与试剂  47-48
    4.1.1 实验菌株  47
    4.1.2 PCR 扩增引物  47
    4.1.3 试剂与仪器设备  47-48
  4.2 实验方法  48-49
    4.2.1 菌株培养  48
    4.2.2 菌株 cry8 型全基因克隆  48-49
  4.3 结果与讨论  49-59
  4.4 小结  59-60
5 CGMCC 1.17 52 菌种发酵中的碳源和氮源的优化  60-64
  5.1 材料与试剂  60
    5.1.1 菌株  60
    5.1.2 培养基  60
    5.1.3 试剂及溶液  60
  5.2 蛋白含量检测的方法  60-61
    5.2.1 标准曲线的制定  60-61
    5.2.2 发酵培养及测定方法  61
  5.3 结果与讨论  61-63
    5.3.1 绘制标准曲线  61-62
    5.3.2 发酵液中蛋白含量的测定  62-63
  5.4 小结  63-64
6 总结  64-65
参考文献  65-68
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  68-69
致谢  69-70

苏云金芽孢杆菌的筛选与伴孢晶体编码基因的克隆与序列分析

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