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球形芽孢杆菌杀蚊毒素基因的克隆、序列分析及表达

作　者: 师永霞
导　师: 袁志明
学　校: 中国科学院武汉病毒研究所
专　业: 微生物学
关键词: 球形芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌二元毒素基因 Mtx 毒素克隆表达
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

不同的球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，B.s）菌株对蚊幼虫具有不同的杀蚊活性和杀虫谱，其中IAB872对敏感致倦库蚊高毒，对B.s抗性致倦库蚊中毒，而LP1-G菌株对两种蚊虫品系都具有中度毒杀作用。为了探讨B.s菌株间杀蚊活性和杀蚊谱差异的分子基础，本文进行了IAB872菌株和LP1-G菌株杀蚊毒素基因的克隆、序列分析和表达。 IAB872菌株的二元毒素基因位于其染色体—3.5Kb HindⅢ片段上。IAB872菌株的总DNA经HindⅢ完全酶切后，回收3.5Kb左右的片段，连接于穿梭载体pBU4上，利用Southern blot和酶切鉴定筛选出含有二元毒素基因所在3.5KbHindⅢ外源片段的重组质粒pBS-1，随之再构建与pBS-1外源片段连接方向相反的重组质粒pBS-2。测序结果表明外源片段由3479个核苷酸组成，其上二元毒素基因的核苷酸序列与2362菌株二元毒素的核苷酸序列完全相同。将pBS-1和pBS-2电激转入苏云金杆菌无晶体型菌株4Q-7（cry^-）中获得转化菌株Bt-BS1和Bt-BS2，SDS-PAGE和Western blot检测证实了IAB872菌株的二元毒素基因在转化菌株中获得了表达，在电镜下可观察到表达的二元毒素蛋白在转化菌株中形成了菱形和不规则形晶体。转化菌株的生测结果表明Bt-BS1和Bt-BS2对敏感蚊幼虫的毒力与野生株IAB872相当，均对敏感蚊幼虫具有高毒力，LC₅₀值分别为2.32×10^-6和5.89×10^-7，但与IAB872野生株的杀蚊活性不同的是，转化菌株对抗性蚊幼虫完全无毒，所以IAB872菌株对抗性蚊幼虫的毒力可能是作用机理不同于二无毒素的Mtx毒素或其它毒素造成的。此外，Bt-BS2的杀蚊毒力高于Bt-BS1，Bt-BS1和Bt-BS2对蚊幼虫毒力的不同可能是由于重组质粒上外源片段的插入方向影响二元毒素基因在受体菌中的表达水平的缘故。另外，本论文还将LP1-G菌株的杀蚊毒素基因在E.coli中进行了克隆。LP1-G菌株的总DNA经HindⅢ随机不完全酶切，纯化后的酶切产物与pUC18载体连接后转化，筛选E.coli转化子，构建部分基因组文库。通过生测的方法从E.coli转化子中筛选出一株对敏感和抗性蚊幼虫均有中等毒力的菌株E-UL68，其对敏感和C3-41抗性蚊幼虫的LC₅₀分别为2.58×10^-4和3.66×10^-4，与LP1-G野生株的毒力相当。测序结果表明外源片段由3876个核苷酸组成，其编码区的核苷酸中国科学院硕士研究生毕业论文序列与SSll．l菌株的mtrl基因完全相同。因为＊心中二元毒素基因的表达产物对敏感和抗性蚊幼虫完全无毒，但该茵株抱子囊时期的发酵液对敏感和抗性蚊幼虫具有中等的毒力，因此，推测 LP IG菌株对蚊幼虫的毒力可能是由于该菌株的mtrl基因表达产生的杀蚊毒素或者该菌株在芽抱形成期表达的其它杀蚊活性因子引起的。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-15
材料和方法  15-23
  1 材料  15-16
  2 方法  16-23
结果和分析  23-38
  1 球形芽孢杆菌IAB872菌株二元毒素基因克隆和表达  23-32
  2 球形芽孢杆菌LP1-G菌株mtx毒素基因的克隆  32-38
讨论  38-41
  1 影响苏云金芽孢杆菌电转化频率的因素  38
  2 影响外源基因在苏云金芽孢杆菌中的表达因素  38-39
  3 B．s对抗性蚊幼虫毒力的可能活性因子  39-40
  4 本实验进一步工作  40-41
参考文献  41-45
附录  45-48
发表文章  48-49
致谢  49

球形芽孢杆菌杀蚊毒素基因的克隆、序列分析及表达

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