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生物有机肥对土传马铃薯青枯病的防控技术及机理研究

作　者: 丁传雨
导　师: 沈其荣; 陈巍
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养
关键词: 马铃薯青枯病解淀粉芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生物防控拮抗机理微生物区系
分类号: S435.32
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

马铃薯青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的细菌性土传病害,是世界范围内马铃薯上的第二大病害,其重要性仅次于晚疫病。目前马铃薯青枯病的防控方法已成为马铃薯生产的研究热点,以生物防控为主导的综合防控是防控该病害的有效方法。本研究从黑龙江、南京、山东和海南等地采集健康植株根际土壤,从中分离出对青枯菌有拮抗作用的根际细菌,并通过进一步室内试验和温室试验筛选出两株能显著抑制马铃薯青枯菌的根际细菌解淀粉芽孢杆菌LH23和枯草芽孢杆菌LH36。另外通过一系列的室内分析、温室盆栽和田间试验,研究了拮抗菌LH23和LH36及其制成的生物有机肥(BI023和BI036)对土传马铃薯青枯病的生防效果及其机理,主要结果如下：1、从番茄、茄子、马铃薯、烟草和香蕉等作物根际土壤中通过喷雾法初筛获得对马铃薯青枯菌有抑菌作用的140多株根际菌株,分离纯化后多次筛选得到两株生长速度快、抗生素抗性强、产芽孢、抗菌谱广泛的高效拮抗菌株LH23和LH362、根据16S rRNA基因序列分析和生理生化特性,菌株LH23被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株LH36被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。同时,研究了拮抗菌LH23和LH36生长的最适发酵条件以及不同生长条件对生防菌LH23和LH36产的拮抗物质抑菌活性的影响。进一步的实验室结果表明：生防菌LH23和LH36具有产吲哚乙酸(IAA)、铁载体、蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白类拮抗物质和脂肽类拮抗物质的能力,同时还具有解磷能力。生防菌LH23和LH36的无菌发酵液加入青枯菌培养基,测得的胞外多糖含量减少。3、灌根法接种与蘸根法接种相比,灌根法接种拮抗菌能更好的在土壤中定殖,促进马铃薯植株生长。温室和田间试验结果表明,生物有机肥(BI023和BI036)能显著促进马铃薯生长和提高马铃薯块茎产量。温室盆栽试验结果表明,生物有机肥(BI023和BI036)处理,马铃薯植株株高、干重、鲜重、根冠比、根总长、根总表面积、根总体积和根平均直径显著高于CK和OF处理(OF即氨基酸肥料和猪粪堆肥1：1混匀制成的普通有机肥)；生物有机肥(BI023和BI036)促进马铃薯植株根际土壤细菌和放线菌数量增加,真菌数量减少。田间试验结果表明,生物有机肥BI023和B1036处理与OF处理相比,产量分别增加17.7%和10.8%,其差异达显著水平。4、不同土壤验证防控效果试验结果显示：生物有机肥能有效防控马铃薯青枯病的发生,促进马铃薯植株生长,提高马铃薯产量。连作带病土温室盆栽试验中,CK发病率为39.7%,BI023和BI036处理对马铃薯青枯病的防病率皆为100%；健康土添加青枯菌温室盆栽试验中,cK发病率为57.7%,BI023和BI036处理对马铃薯青枯病的防病率分别为84.6%和80.8%。在两块青枯病感染程度不同的两块马铃薯田块(田块1感染程度较轻,青枯病发病率为8.3%；田块2感染程度较重,青枯病发病率为18.3%),进行马铃薯青枯病生防试验,结果表明：在田块1中,BI023和BI036处理的防病率分别为92.0%和84.0%,与OF处理相比产量分别提高42.3%和28.8%；在田块2中,BI023和BI036处理的防病率分别为65.6%和57.7%,与OF处理相比产量分别提高56.8%和45.1%。生物有机肥能有效防控马铃薯青枯病,并显著提高马铃薯产量。5、施用生物有机肥可以改善马铃薯植株根际土壤微生物区系。不同土壤盆栽试验结果表明,对不同时期马铃薯植株根际土壤微生物计数结果显示,与CK相比,施用生物有机肥(BI023和BI036)显著促进马铃薯植株根际土壤细菌、放线菌的数量增加,真菌的数量减少。同时,与单一施用生防菌菌悬液处理(LH23和LH36)相比,生物有机肥(BI023和BI036)处理马铃薯植株根际土壤拮抗菌数量显著增加,马铃薯植株根际土壤青枯菌数量显著降低,防病率显著提高。田间试验中的根际土壤微生物区系变化与盆栽结果一致。同时生物有机肥显著提高马铃薯植株叶片过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)活性,降低丙二醛(MDA)含量,减轻发病情况,提高马铃薯植物的系统抗性。综上所述,拮抗菌株与有机肥结合制成的生物有机肥(BI023和BI036)能有效防控马铃薯青枯病的发生,并促进马铃薯植株的生长、提高产量和改善品质。施用生物有机肥能促进拮抗菌在土壤和根际中的定殖和生存,有效降低青枯菌的数量,同时改善马铃薯植株根际微生物区系,提高植株系统抗性。本文的研究结果有助于研发马铃薯土传病害防控技术,为马铃薯青枯病的有效防控提供理论基础。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
缩略语及专有词汇表  14-15
第一章文献综述  15-37
  1 马铃薯青枯病概述  15-22
    1.1 马铃薯青枯病的发病情况  15-16
    1.2 马铃薯青枯病病原菌  16-22
  2 马铃薯青枯病的防治  22-34
    2.1 抗性品种的筛选  22-23
    2.2 化学防治  23
    2.3 农业措施防治  23
    2.4 生物防治  23-29
    2.5 生物有机肥研究进展  29-32
    2.6 枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的生防机制  32-34
  3 研究目的  34-37
    3.1 研究目的和意义  34-35
    3.2 技术路线  35-37
第二章马铃薯青枯病病原菌及拮抗菌的筛选  37-55
  1 材料方法  37-42
    1.1 试验材料  37-38
    1.2 马铃薯青枯病病原菌分离及致病性鉴定方法  38-39
    1.3 拮抗菌的筛选  39-42
    1.4 数据处理  42
  2 结果分析  42-51
    2.1 马铃薯青枯病病原菌分离及致病性检测  42-45
      2.1.1 马铃薯青枯病病原菌分离及筛选  42-43
      2.1.2 马铃薯青枯病病原菌致病性筛选  43-44
      2.1.3 青枯菌TZR3的生化型测定和小种划分  44
      2.1.4 青枯菌TZR3的抗生素敏感性试验  44-45
    2.2 拮抗菌的筛选  45-51
      2.2.1 拮抗菌的初筛  45-47
      2.2.2 拮抗菌真菌抗菌谱  47-48
      2.2.3 拮抗菌及其无菌发酵液对不同小种青枯菌的抑制作用  48-50
      2.2.4 不同拮抗菌株对马铃薯青枯病的防控效果  50
      2.2.5 菌株LH23和LH36对土传病害不同真菌病原菌的拮抗谱  50-51
  3 讨论  51-52
  4 小结  52-55
第三章生防菌LH23和LH36的鉴定及生物学特性研究  55-85
  1 材料与方法  55-62
    1.1 材料  55-56
    1.2 生理生化特征及分子生物学鉴定  56-58
    1.3 不同生长条件对生防菌LH23和LH36的影响  58-59
    1.4 菌株LH23和LH36的抗生素敏感性试验  59
    1.5 不同生长条件对生防菌LH23和LH36拮抗活性的影响  59-60
    1.6 生防菌LH23和LH36拮抗物质活性的稳定性  60
    1.7 生防菌LH23和LH36的拮抗及促生因子  60-62
    1.8 数据处理  62
  2 结果和分析  62-80
    2.1 生防菌LH23和LH36的形态特征、生理生化特征及分子学鉴定  62-65
      2.1.1 形态特征  62-63
      2.1.2 16S rRNA基因序列分析  63-64
      2.1.3 生理生化特征  64-65
    2.2 不同生长条件对生防菌LH23和LH36的影响  65-69
    2.3 生防菌LH23和LH36对抗生素的敏感性试验结果  69-70
    2.4 不同培养条件对生防菌LH23和LH36产拮抗物质抑菌活性的影响  70-75
    2.5 生防菌LH23和LH36拮抗物质的稳定性  75-77
    2.6 生防菌LH23和LH36的促生及拮抗因子  77-80
  3 讨论  80-83
  4 小结  83-85
第四章生防菌LH23和LH36及其制成的生物有机肥BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的防控作用  85-113
  第一节 BIO23和BIO36对马铃薯的促生作用  85-92
    1 材料和方法  85-88
      1.1 材料  85-86
      1.2 定殖试验  86
      1.3 盆栽试验：BIO23和BIO36对马铃薯苗期的促生作用  86-87
      1.4 田间试验：BIO23和BIO36对马铃薯的田间促生作用  87-88
      1.5 数据分析  88
    2 结果和分析  88-92
      2.1 生防菌LH23和LH36不同接种方式对马铃薯苗期的促生作用  88-90
      2.2 BIO23和BIO36对马铃薯苗期的促生作用  90-92
      2.3 BIO23和BIO36对马铃薯的田间促生效果  92
  第二节 BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的防控作用  92-113
    1 材料和方法  92-97
      1.1 供试材料  92
      1.2 温室盆栽试验：不同土壤条件下BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的防控效果  92-94
      1.3 BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的田间防效  94-97
      1.4 数据分析  97
    2 结果  97-108
      2.1 温室防效：不同土壤条件下BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的防效  97-102
        2.1.1 盆栽试验一：在带病土中BIO23和BIO36对马铃薯青枯病的防效  97-98
        2.1.2 盆栽试验二：健康土添加青枯菌条件下BIO23和BIO36的防效  98-102
      2.2 田间防效  102-108
        2.2.1 田间试验一：同一施用量BIO23和BIO36对不同田块的防效  102-103
        2.2.2 田间试验二：不同施用量BIO23和BIO36对同一田块的防效  103-108
    3 讨论  108-111
    4 小结  111-113
第五章 BIO23和BIO36对马铃薯植株根际土壤微生物的影响  113-125
  1 材料方法  113-115
    1.1 材料  113-114
    1.2 温室试验：不同土壤条件下BIO23和BIO36对马铃薯根际土壤微生物的影响  114
    1.3 田间试验  114
    1.4 微生物测定  114-115
    1.5 数据分析  115
  2 结果分析  115-122
    2.1 温室试验：不同土壤条件下BIO23和BIO36对马铃薯根际土壤微生物的影响  115-119
      2.1.1 温室试验一：BIO23和BIO36对马铃薯苗期根际土壤微生物的影响  115-116
      2.1.2 温室试验二：在连作带病土中BIO23和BIO36对马铃薯根际土壤微生物的影响  116
      2.1.3 温室试验三：在健康土添加青枯菌情况下BIO23和BIO36对马铃薯根际土壤微生物的影响  116-119
    2.2 田间试验BIO23和BIO36对马铃薯根际土壤微生物的影响  119-122
      2.2.1 对马铃薯根际土壤青枯菌的影响  119-120
      2.2.2 对马铃薯根际土壤拮抗菌(LH23和LH36)的影响  120
      2.2.3 对马铃薯根际土壤细菌数量的影响  120-121
      2.2.4 对马铃薯根际土壤真菌数量的影响  121
      2.2.5 对马铃薯根际土壤放线菌数量的影响  121-122
  3 讨论  122-123
  4 小结  123-125
第六章 BIO23和BIO36对马铃薯植株系统抗性的影响  125-133
  1 材料和方法  125-128
    1.1 材料  125
    1.2 BIO23和BIO36对马铃薯植株系统抗性的影响  125
    1.3 酶活性的测定  125-128
    1.4 数据处理  128
  2 结果  128-131
    2.1 BIO23和BIO36对马铃薯植株MDA含量的影响  128
    2.2 BIO23和BIO36对马铃薯植株CAT酶活性的影响  128-129
    2.3 BIO23和BIO36对马铃薯植株POD酶活性的影响  129
    2.4 BIO23和BIO36对马铃薯植株SOD酶活性的影响  129-130
    2.5 BIO23和BIO36对马铃薯植株PPO酶活性的影响  130-131
    2.6 BIO23和BIO36对马铃薯植株可溶性蛋白含量的影响  131
  3 讨论  131-132
  4 小结  132-133
全文结论  133-135
创新点  135-137
参考文献  137-155
附录  155-157
攻读博士期间发表的学术论文和已获专利  157-159
致谢  159

生物有机肥对土传马铃薯青枯病的防控技术及机理研究

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