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294个稻瘟病菌转录因子基因的敲除和功能分析

作　者: 张莉林
导　师: 卢建平
学　校: 浙江大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 稻瘟病菌 基因敲除 转录因子 生长 产孢 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
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内容摘要


稻瘟病(rice blast)是严重危害水稻的病害之一,造成了水稻产量的严重损失。稻瘟病(Magnaporthe oryzae)是一种丝状子囊真菌,除水稻外,稻瘟病菌还可以侵染如小麦、大麦,玉米等多种禾本科植物。稻瘟病菌70-15菌株全基因组序列测序已于2002年10月完成,为深入研究稻瘟病菌的致病机理和发育机制提供了坚实的基础。稻瘟病菌的基因表达受多级调控,而转录水平的调控是基因表达过程的第一步,也是最重要的一步。转录因子是基因表达调控的关键因子。通过基因敲除方法,将转录因子基因敲除,观察缺失该转录因子后,稻瘟病菌的表型及致病性变化,是一种研究基因功能的有效手段。一个转录因子可以调控多个靶基因,一个基因也同时受到多个转录因子的调控,从而形成复杂的基因表达网络调控机制,因而仅对少数几个转录因子的研究已不能满足需要。本文通过敲除大量转录因子基因,为研究稻瘟病菌的基因功能以信号传导通路,代谢调节网络提供技术支持。对bHLH、bZIP、HMG、Homeodomain及锌指基序等5个疑似转录因子家族的294个基因进行了基因敲除研究：成功构建了277个基因的敲除载体；通过ATMT转化方法对稻瘟病菌进行转录因子基因敲除实验,获得171个转录因子基因的敲除突变体。在171个转录因子基因敲除突变体中,测定了167个基因的突变子表型,发现49个基因的敲除影响到稻瘟菌的生长、产孢、致病性：其中9个基因影响生长速度,24个基因影响产孢,16个基因影响致病性,说明这些转录因子在稻瘟病菌生长发育及致病性过程中具有非常重要的功能。继续深入研究这些转录因子及其所调控的基因和调控过程,对于更深入的了解稻瘟病菌的基因调控网络,并对于理解其致病机制具有重要意义。

全文目录


致谢  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
目录  11-15
第一章 文献综述  15-40
  1 稻瘟病与稻瘟病菌  15-19
    1.1 稻瘟病概况  15
    1.2 稻瘟病菌的生活史  15-16
    1.3 稻瘟病菌在寄主叶片的侵染循环  16-19
      1.3.1 分生孢子萌发  17
      1.3.2 芽管形成  17
      1.3.3 附着胞的形成及发育  17-18
      1.3.4 侵染栓形成和侵入  18
      1.3.5 产孢与再侵染  18-19
    1.4 稻瘟病菌的根部侵染过程  19
    1.5 稻瘟病菌致病性及生理小种  19
  2 真核细胞中的转录因子  19-28
    2.1 转录因子概况  20-21
    2.2 转录因子功能域  21-22
    2.3 转录因子家族  22-27
      2.3.1 碱性亮氨酸拉链类转录因子  23
      2.3.2 碱性螺旋-环-螺旋类转录因子  23-24
      2.3.3 HMG类转录因子  24-25
      2.3.4 同源结构域类转录因子  25-26
      2.3.5 锌指蛋白类转录因子  26-27
    2.4 转录因子一般研究策略  27-28
  3 基因敲除方法  28-38
    3.1 基因敲除概述  28-29
    3.2 基因敲除方法  29-38
      3.2.1 基因的同源重组  29-32
      3.2.2 RNAi  32-33
      3.2.3 锌指核酸酶技术  33-35
      3.2.4 TALEN技术  35-36
      3.2.5 核酸内切酶Cas  36-38
  4 选题意义与实验技术  38-40
    4.1 选题意义  38
    4.2 实验技术  38-40
      4.2.1 实验技术流程  38-39
      4.2.2 实验技术创新点  39-40
第二章 材料与方法  40-51
  1 试验材料  40-43
    1.1 试验菌株  40
    1.2 供试植物  40
    1.3 质粒载体  40
    1.4 试剂  40-41
    1.5 仪器  41
    1.6 培养基配制  41-43
      1.6.1 稻瘟病菌培养基  41-43
      1.6.2 农杆菌诱导培养基(Agrobacterium tumefaciens Induced Medium,AIM)  43
  2 实验方法  43-51
    2.1 PCR  43-45
      2.1.1 常规PCR  43-44
      2.1.2 实时荧光定量PCR  44
      2.1.3 用于转化子的PCR验证  44-45
    2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳分析  45-46
    2.3 遗传转化  46-47
      2.3.1 农杆菌的冻融法转化  46-47
        2.3.1.1 农杆菌AGL1感受态细胞的制备  46
        2.3.1.2 农杆菌AGL1感受态细胞的转化  46-47
      2.3.2 稻瘟病菌的T-DNA转化  47
    2.4 基因组DNA操作  47-49
      2.4.1 稻瘟病菌基因组DNA的小量提取  47-48
      2.4.2 CTAB法提取稻瘟病菌基因组DNA  48-49
    2.5 稻瘟病菌生物学及侵染过程病理学观察  49-51
      2.5.1 菌株的保存与培养  49
        2.5.1.1 菌株的保存  49
        2.5.1.2 菌株的培养  49
      2.5.2 稻瘟病菌的表型观察  49-51
        2.5.2.1 生长速率的测定  49
        2.5.2.2 产孢量的测定  49-50
        2.5.2.3 孢子萌发率的测定  50
        2.5.2.4 孢子的附着胞形成率  50
        2.5.2.5 大麦离体接种测致病性  50-51
第三章 转录因子基因敲除  51-64
  1 ATMT转化和GFP荧光筛选  51-54
  2 基因敲除突变体的再次验证  54-62
    2.1 bHLH转录因子的基因敲除结果  55-56
    2.2 bZIP转录因子的基因敲除结果  56
    2.3 HMG转录因子的基因敲除结果  56-57
    2.4 HD转录因子的基因敲除结果  57-58
    2.5 锌指蛋白转录因子的基因敲除结果  58-62
      2.5.1 DHHC锌指蛋白转录因子的基因敲除结果  58
      2.5.2 CCHC锌指蛋白转录因子的基因敲除结果  58-59
      2.5.3 C2H2锌指蛋白转录因子基因敲除  59-60
      2.5.4 Zn2Cys6锌指蛋白转录因子基因敲除  60-62
    2.6 不同类型结构域转录因子的敲除效率分析  62
  3 Real time PCR检测插入片段拷贝数  62-64
第四章 转录因子基因敲除结果与分析  64-98
  1 bHLH转录因子基因  64-66
    1.1 菌落生长特性  64
    1.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  64-65
    1.3 致病性  65-66
  2 bZIP转录因子基因  66-69
    2.1 菌落生长特性  66-67
    2.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  67-68
    2.3 致病性  68-69
  3 HMG转录因子基因  69-73
    3.1 菌落生长特性  69-71
    3.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  71-72
    3.3 致病性  72-73
  4 HD转录因子基因  73-76
    4.1 菌落生长特征  74
    4.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  74-75
    4.3 致病性  75-76
  5 锌指蛋白转录因子基因  76-96
    5.1 DHHC锌指转录因子基因  76-78
      5.1.1 菌落生长特性  76-77
      5.1.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  77
      5.1.3 致病性  77-78
    5.2 CCHC锌指转录因子基因  78-80
      5.2.1 菌落生长特性  79
      5.2.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  79-80
      5.2.3 致病性  80
    5.3 C2H2锌指转录因子基因  80-88
      5.3.1 菌落生长特性  81-84
      5.3.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  84-86
      5.3.3 致病性  86-88
    5.4 Zn2Cys6锌指转录因子基因  88-96
      5.4.1 菌落生长特性  89-92
      5.4.2 生长速率、产孢量、孢子萌发率、附着胞形成率  92-94
      5.4.3 致病性  94-96
  6 讨论  96-98
    6.1 小结  96
    6.2 后期工作  96-98
参考文献  98-105
附录  105-115

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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