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CodY蛋白在嗜热链球菌氮代谢调控中的作用研究

作　者: 崔海月
导　师: 许晓曦; 刘芳
学　校: 东北农业大学
专　业: 食品工程
关键词: 嗜热链球菌 CodY蛋白转录调控氮代谢
分类号: TS252.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

嗜热链球菌作为酸奶发酵剂的一个关键组成部分，对酸奶质地和风味的形成具有重要作用。由于菌株的生长需要充足的碳源、氮源供应，因此对菌株碳源氮源利用能力的调控成为改善菌株生长的一个重要手段，而对于嗜热链球菌氮代谢的调控方面的研究报道较少，绝大多数数据是从乳酸乳球菌推断而来的。CodY是存在于革兰氏阳性细菌中的一种全局性转录调控因子，可以对200多个基因的表达进行调控，这些基因一般在对数生长时期时受到阻遏，在营养物质缺乏步入稳定期之后又被诱导获得表达，进而帮助细胞来适应营养僵乏的时期。根据已公布的嗜热链球菌基因组信息（NC₀06449和NC₀08532等）推断，发酵酸奶最广泛使用发酵剂中的嗜热链球菌中也应含有一个类似的调控蛋白CodY，因此本研究主要通过构建过量表达CodY蛋白的嗜热链球菌突变株来分析该蛋白在嗜热链球菌中的作用机制，试图寻找CodY蛋白对嗜热链球菌的氮代谢的影响。本课题根据对嗜热链球菌KLDS3.0503的内源质粒进行分析，确认其可以作为宿主细胞，提取DNA并设计相应引物扩增出了codY基因。对pMEU5α载体的质粒进行酶切验证后与codY片段进行连接，成功构建了CodY过表达重组质粒，为了能够更好的验证CodY的作用，与此同时又构建了载体自连质粒，二者均成功电转化入无质粒菌株KLDS3.0503。利用已有的表达载体pNZCodY，经Nisin诱导在乳酸乳球菌中表达出CodY蛋白，并使用HisTrap FF柱纯化得到了重组蛋白His-CodY并鉴定该蛋白。通过SDS-PAGE蛋白电泳、OD值的变化趋势来验证CodY对其蛋白表达及生长趋势的影响。根据NCBI中公布的嗜热链球菌的全基因组序列查找出与其氮代谢相关的十三个基因分别为prtM、amiD、ilvA、ilvC、ilvD1、gdhA、CodY、bcaT、argF、pepA、pepS、pepN、pepC，通过RT-Real Time PCR对这十三个基因进行比较，说明CodY蛋白能够控制这些基因的表达。本课题得出如下结论：1.通过16S rRNA基因序列的测定鉴定了嗜热链球菌KLDS3.0503，并通过质粒分析确认其可以作为宿主细胞。2.成功从嗜热链球菌KLDS3.0503中克隆出了codY基因片段。3.构建的CodY过量表达载体及自连载体成功的在嗜热链球菌KLDS3.0503中得到复制，并对二者生长趋势进行OD值监测，得出CodY蛋白可以调控原始菌株的生长趋势。4.通过SDS-PAGE蛋白电泳明显判断出CodY蛋白的表达量的差异，并对已有的codY蛋白进行纯化并鉴定，二者相吻合。5.通过荧光定量PCR的方法，得出prtM、amiD、ilvA、ilvC、ilvD1、gdhA、bcaT、argF、pepS、pepC的相对表达量都有明显的降低，只有pepA、pepN表达量略有升高，codY基因由于是过量表达而含量是最高的。进而说明CodY蛋白可以调控与嗜热链球菌氮代谢相关的十三个基因。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-18
  1.1 嗜热链球菌  11
  1.2 嗜热链球菌的氮代谢途径  11-12
  1.3 CodY 的研究进展  12-16
    1.3.1 全局性转录调控因子 CodY 的概述  12
    1.3.2 CodY 蛋白的结构  12-13
    1.3.3 CodY 蛋白对嗜热链球菌氮代谢的调控机制  13-14
    1.3.4 CodY 在其他革兰氏阳性菌中的调控作用  14-16
  1.4 研究目的和意义  16
  1.5 主要研究内容  16-18
2 材料与方法  18-35
  2.1 嗜热链球菌 16S rRNA 基因序列的测定  18-20
    2.1.1 材料与设备  18-19
    2.1.2 试验方法  19-20
  2.2 嗜热链球菌内源质粒的分析  20-21
    2.2.1 材料与设备  20
    2.2.2 试验方法  20-21
  2.3 嗜热链球菌 CodY 基因的克隆和分析  21-24
    2.3.1 材料与设备  21
    2.3.2 试验方法  21-24
  2.4 pMEU5α/CodY 重组质粒及 pMEU5α自连质粒的构建  24-29
    2.4.1 材料与设备  24-25
    2.4.2 实验方法  25-29
  2.5 嗜热链球菌 CodY 蛋白在乳酸乳球菌 NZ9000 中的外源表达及纯化  29-31
    2.5.1 材料与设备  29-30
    2.5.2 试验方法  30-31
  2.6 CodY 的表达对嗜热链球菌生长和氮代谢部分相关基因表达量的影响  31-35
    2.6.1 材料与设备  31-32
    2.6.2 实验方法  32-35
3 结果与分析  35-46
  3.1 嗜热链球菌 16S RRNA 基因序列的测定  35
  3.2 嗜热链球菌质粒的分析  35-36
  3.3 嗜热链球菌 CodY 基因的克隆和分析  36-37
  3.4 pMEU5α/CodY 质粒及 pMEU5α自连质粒的构建  37-41
    3.4.1 pMEU5α载体酶切位点的鉴定  37
    3.4.2 pMEU5α/CodY 质粒的构建  37-39
    3.4.3 pMEU5α载体自连质粒的构建  39-40
    3.4.4 pMEU5α自连质粒及 pMEU5α/CodY 重组质粒电转化  40-41
  3.5 嗜热链球菌 CodY 蛋白在乳酸乳球菌 NZ9000 中的外源表达和纯化  41-43
  3.6 CodY 的表达对嗜热链球菌生长和氮代谢部分相关基因表达量的影响  43-46
    3.6.1 OD 值的比较  43
    3.6.2 CodY 蛋白表达量的比较  43-44
    3.6.3 荧光定量 PCR  44-46
4 讨论  46-50
  4.1 嗜热链球菌 16S rRNA 基因序列的测定  46
  4.2 嗜热链球菌内源质粒的分析  46-47
  4.3 嗜热链球菌 CodY 基因的克隆和分析  47
  4.4 pMEU5α/CodY 重组质粒及 pMEU5α自连质粒的构建  47-48
  4.5 嗜热链球菌 CodY 蛋白在 NZ9000 中的外源表达和纯化  48
  4.6 CodY 的表达对嗜热链球菌KLDS3.0503生长和与氮代谢部分相关基因表达量的影响  48-50
5 结论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-58
附录  58-60
攻读硕士学位期间发表的学术论文  60

CodY蛋白在嗜热链球菌氮代谢调控中的作用研究

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