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蓝莓中黄酮类物质的提取、分离纯化及生物活性研究

作　者: 田瑶
导　师: 徐雅琴
学　校: 东北农业大学
专　业: 应用化学
关键词: 蓝莓黄酮类物质提取分离纯化生物活性
分类号: TQ914
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

以蓝莓果实为原料,研究花色苷和黄酮醇的提取及分离纯化方法,并对纯化后的花色苷和黄酮醇样品进行结构鉴定及活性研究,为充分开发利用这一资源提供了科学依据。利用超声波辅助法提取蓝莓中的花色苷和黄酮醇,采用响应面试验设计对试验条件进行优化,确定该方法的最佳条件：超声功率512.7W,超声时间29.8min,液料比为9.5：1mL/g。此条件下的理论预测黄酮醇提取量为0.804mg/g,花色苷提取量为2.899mg/g。验证试验条件：超声功率510W,超声时间30min,液料比10：1mL/g,黄酮提取量为0.806mg/g,花色苷提取量为2.903mg/g,与预测值比较吻合。在分离纯化工艺中,采用中压柱层析法,依次选择大孔吸附树脂、Sephadex LH-20为柱填料,对蓝莓中的花色苷和黄酮醇粗提液分别进行分离纯化。通过静态试验比较了六种大孔吸附树脂对花色苷的吸附及解吸效果,筛选出D101为最佳树脂。用D101大孔吸附树脂中压柱层析法研究动态试验,得到最佳纯化条件为：选择上样液浓度为0.073mg/mL,上样体积10mL,流速5mL/min,80%乙醇溶液为洗脱液,此条件下的花色苷回收率为96.61%,大孔树脂纯化前花色苷粗提液纯度为5.53%,纯化后样品纯度为75.58%；通过静态试验比较七种大孔吸附树脂对黄酮醇吸附及解吸效果,筛选出S-8为吸附和解析性能均较佳的树脂。用S-8大孔吸附树脂中压柱层析法研究动态试验,得到最佳纯化条件为：选择上样浓度0.362mg/mL,上样体积10mL,流速2mL/min,95%乙醇溶液为洗脱液,此条件下的回收率为92.83%,大孔树脂纯化前黄酮粗提液纯度为5.03%,纯化后样品纯度为55.58%。采用Sephadex LH-20中压柱层析法对大孔树脂纯化后的花色苷进行精细分离,得到最佳分离条件为：上样浓度为1.0mg/mL,上样体积10mL,20%、35%、50%甲醇梯度洗脱,20%甲醇时,流速1.0mL/min;35%甲醇,50%甲醇时,流速3.0mL/min,分离得到较单一的两种组分,其中对组分Ⅰ进行鉴定为矢车菊-3-葡萄糖苷,HPLC测定纯度90.88%。Sephadex LH-20中压柱层析法对大孔树脂纯化后的黄酮醇进行精细分离,得到最佳分离条件为：上样浓度1.0mg/mL,上样体积10mL,流速1mL/min,50%、70%、无水甲醇梯度洗脱,分离得到较单一的两种组分,其中对组分Ⅰ进行鉴定为槲皮素,HPLC测定纯度89.10%,组分Ⅱ初步判定可能为杨梅酮。从反应的三个阶段进行研究蓝莓花色苷的抗非酶糖基化活性。结果表明,随着花色苷浓度的增加,抑制作用也随之增加,随着时间的延长,抑制率先增加后降低。经大孔树脂纯化后浓度为0.2mg/mL的花色苷对NBT还原实验的抑制率为11.80%,对二羰基化合物生成的抑制率为39.44%,对糖基化终产物的抑制作用在加入糖基化体系第三天时达到最大45.44%,说明花色苷对非酶糖基化具有一定的抑制作用,主要发生在中后阶段,对NBT还原实验的抑制作用不是很明显。

全文目录

摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
1 前言  13-26
  1.1 蓝莓概述  13
  1.2 黄酮类化合物的概述  13-14
    1.2.1 黄酮类化合物的结构与分类  14
    1.2.2 黄酮类化合物的性质  14
  1.3 黄酮类化合物提取方法的概述  14-17
    1.3.1 热水提取法  14-15
    1.3.2 碱液提取  15
    1.3.3 有机溶剂提取法  15
    1.3.4 超声波辅助提取法  15-16
    1.3.5 微波辅助提取法  16
    1.3.6 超临界流体萃取法  16
    1.3.7 酶解法  16-17
    1.3.8 双水相提取法  17
    1.3.9 半仿生提取法  17
  1.4 黄酮类化合物的分离纯化方法  17-20
    1.4.1 柱色谱  17-19
    1.4.2 大孔树脂纯化法  19
    1.4.3 高效液相色谱法(HPLC)  19
    1.4.4 高速逆流色谱法(HSCCC)  19-20
  1.5 黄酮类化合物的生理活性  20-22
    1.5.1 抗氧化、清除自由基作用  20
    1.5.2 抗癌、抗肿瘤作用  20
    1.5.3 保护心血管系统作用  20-21
    1.5.4 抗炎、抗菌作用  21
    1.5.5 抗糖基化作用  21-22
  1.6 黄酮类化合物的分析及结构鉴定  22-23
    1.6.1 紫外光度法  22
    1.6.2 红外光谱法  22
    1.6.3 高效液相色谱-质谱  22-23
    1.6.4 核磁共振谱  23
  1.7 蓝莓中黄酮类化合物的研究进展  23-25
  1.8 立题意义及研究内容  25-26
    1.8.1 立题意义  25
    1.8.2 研究内容  25-26
2 材料与方法  26-42
  2.1 试验材料  26-28
    2.1.1 原料及来源  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 主要仪器设备  27
    2.1.4 大孔吸附树脂  27-28
  2.2 试验方法  28-42
    2.2.1 工艺流程  28
    2.2.2 含量的测定  28-29
    2.2.3 超声波辅助法提取花色苷及黄酮醇  29-31
    2.2.4 大孔树脂对蓝莓花色苷和黄酮醇的初步纯化  31-35
    2.2.5 Sephadex LH-20对蓝莓中花色苷和黄酮醇的分离纯化  35-37
    2.2.6 蓝莓中花色苷和黄酮醇的分析鉴定  37-39
    2.2.7 抗糖基化活性研究  39-42
3 结果分析与讨论  42-77
  3.1 蓝莓中花色苷和黄酮醇含量的测定  42-44
    3.1.1 花色苷测定波长的确定  42
    3.1.2 黄酮醇含量的测定  42-44
  3.2 超声波辅助提取法最佳工艺的确定  44-52
    3.2.1 单因素试验结果  44-46
    3.2.2 响应面试验设计与结果分析  46-51
    3.2.3 小结  51-52
  3.3 大孔树脂对花色苷和黄酮醇的初步纯化结果  52-62
    3.3.1 大孔树脂对花色苷的初步纯化结果  52-59
    3.3.2 大孔树脂对黄酮醇的初步纯化结果  59-62
    3.3.3 小结  62
  3.4 Sephadex LH-20对花色苷和黄酮醇的纯化结果  62-71
    3.4.1 Sephadex LH-20对花色苷纯化结果  62-65
    3.4.2 Sephadex LH-20对黄酮醇纯化结果  65-71
    3.4.3 小结  71
  3.5 花色苷抗糖基化活性研究  71-77
    3.5.1 NBT还原实验  71-73
    3.5.2 二羰基化合物的测定  73-75
    3.5.3 非酶糖基化终产物的测定  75-76
    3.5.4 小结  76-77
4 结论  77-78
致谢  78-79
参考文献  79-86
攻读硕士期间发表的学术论文  86-87
附录  87-92

蓝莓中黄酮类物质的提取、分离纯化及生物活性研究

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