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蜡梅亲免素基因CpFKBP的克隆及功能初步分析

作　者: 王斐
导　师: 李名扬
学　校: 西南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 蜡梅 亲免素 FKBP PPIase 原核表达 转化烟草
分类号: S685.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 21次
引　用: 1次
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内容摘要


FKBPs是亲免素(Immunophilin)家族的一员,目前在大豆、玉米、蓖麻、番茄、葡萄等植物中已经成功分离,并克隆得到它们的FKBP基因。FKBPs可与免疫抑制剂FK506和雷帕霉素特异性地结合从而产生免疫抑制作用。同时,FKBPs具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性,能够催化蛋白质的折叠、装配和转运,在植株的生长发育过程中扮演着重要的角色。本研究在构建好的蜡梅花cDNA文库中克隆得到一个蜡梅FKBP基因,再对该基因进行分子序列特征分析,原核表达,酶活性测定和转化烟草的分析。本实验的具体结果如下：1、蜡梅亲免素基因的克隆以及分子特征分析在已构建好的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础之上,随机克隆测序得到一个蜡梅FKBP基因,克隆得到的蜡梅CpFKBP cDNA的全长为482bp,最大ORF框为339bp,该基因一共编码了113个氨基酸,预测等电点为8.48,其理论分子量约为12.08KD。在本研究中将其命名为CpFKBP(GenBank登录号：JQ337962)。分子特征分析发现蜡梅FKBP基因编码的蛋白与毛果杨,蒺藜苜蓿等FKBPs氨基酸序列的相似性接近90%,在结构上蜡梅FKBP属于单结构域亲免素。CpFKBP所编码的蛋白.其二级结构主要由58.93%的随机卷曲、28.57%的延伸链和12.5%的α螺旋构成,其编码的蛋白不存在跨膜结构,无信号肽,且具有良好的疏水性,有4个磷酸化位点。2.CDFKBP原核表达载体构建、表达体系优化及PPIase酶活分析在CpFKBP两端加上BamHI和SacI酶切位点,通过克隆载体pMD19-T将CpFKBP连接到载体pET-32a(+)上,再转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)进行诱导表达。从诱导温度、诱导表达时间和IPTG终浓度三个方面系统优化表达体系。经优化重组蛋白在低温16℃条件下诱导24小时可达到最高表达量。PPIase活性分析显示重组蛋白具有较高的异构酶活性。3.CpFKBP基因植物表达载体构建及对烟草转化CpFKBP两端加上BAmHI和Sac I酶切位点,再与pMD19-T连接,分别用BamHI和SacI双酶切pMD19-T/CpFKBP和表达载体pCAMBIA2301g,将回收目的片段连接,获得重组质粒pCAMBIA2301g-CpFKBP。采用电转法,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404。再采用叶盘法转化烟草,获得具有Km+抗性的烟草植株,通过GUS检测和PCR检测,最终获得20株转基因烟草单株系。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第1章 文献综述  11-19
  1.1 亲免素的发现  11
  1.2 亲免素的研究现状  11-13
    1.2.1 植物亲免素  11-12
    1.2.2 动物亲免素  12-13
  1.3 亲免素的分类及结构特点  13
  1.4 FKBPs的结构  13-14
  1.5 FKBPs的生物学性质及其与免疫抑制剂的作用机制  14-17
    1.5.1 PPIase活性  14-15
    1.5.2 分子伴侣  15-16
    1.5.3 与免疫抑制剂的相互作用  16-17
  1.6 FKBPs临床研究现状及前景  17-19
    1.6.1 FKBPs与神经退行性疾病  17-19
第2章 引言  19-21
第3章 蜡梅CpFKBP基因的克隆及序列分析  21-37
  3.1 实验材料  21-22
    3.1.1 蜡梅花cDNA文库  21
    3.1.2 菌株和载体  21
    3.1.3 主要试剂  21
    3.1.4 主要实验设备  21
    3.1.5 常用自配试剂  21-22
    3.1.6 基本培养基  22
  3.2 实验方法  22-27
    3.2.1 EST序列特征分析  22-23
    3.2.2 蜡梅CpFKBP cDNA的获得  23-27
  3.3 结果与分析  27-34
    3.3.1 CpFKBP的cDNA全长获得  27
    3.3.2 CpFKBP cDNA的序列特征  27
    3.3.3 CpFKBP的Blast分析和的蛋白同源性分析  27-29
    3.3.4 CpFKBP编码蛋白的信号肽分析  29-30
    3.3.5 CpFKBP编码蛋白的二级结构预测  30-31
    3.3.6 CpFKBP编码蛋白3D模型预测  31
    3.3.7 CpFKBP编码蛋白的卷曲螺旋预测  31-32
    3.3.8 CpFKBP编码蛋白的跨膜结构分析  32-33
    3.3.9 CpFKBP编码蛋白的疏水性区域分析  33
    3.3.10 CpFKBP编码蛋白的磷酸化位点分析  33-34
  3.4 讨论  34-37
第4章 蜡梅CpFKBP基因的原核表达载体构建及融合蛋白表达  37-53
  4.1 试验材料和试剂  37-40
    4.1.1 试验材料  37-38
    4.1.2 试验主要试剂  38
    4.1.3 主要实验设备  38
    4.1.4 自配试剂  38-40
  4.2 试验方法  40-45
    4.2.1 蜡梅FKBP基因表达载体的构建  40-43
    4.2.2 CpFKBP融合蛋白的表达  43
    4.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白表达情况  43
    4.2.4 表达体系的优化  43-44
    4.2.5 重组蛋白分离纯化  44-45
    4.2.6 重组蛋白浓度测定  45
    4.2.7 重组蛋白的PPlase活性检测  45
  4.3 结果与分析  45-52
    4.3.1 蜡梅CpFKBP基因原核表达载体的构建  45-46
    4.3.2 pET-32a/CpFKBP重组蛋白的表达  46-48
    4.3.3 表达体系优化  48-50
    4.3.4 重组蛋白的纯化  50
    4.3.5 重组蛋白浓度测定  50-51
    4.3.6 重组蛋白酶活性测定  51-52
  4.4 讨论  52-53
第5章 植物表达载体的构建以及转化烟草  53-63
  5.1 实验材料  53-55
    5.1.1 转化植物材料  53
    5.1.2 菌株与载体  53
    5.1.3 主要试剂  53
    5.1.4 自配试剂  53-54
    5.1.5 基本培养基配方  54-55
  5.2 实验方法  55-59
    5.2.1 植物表达载体pCAMBIA2301g-CpFKBP的构建  55-58
    5.2.2 目的基因导入烟草及转化植株的获得  58-59
    5.2.3 检测转基因烟草  59
  5.3 结果与分析  59-62
    5.3.1 植物表达载体的构建  59-60
    5.3.2 CpFKBP基因转化烟草  60-62
  5.4 讨论  62-63
第6章 总结  63-65
  6.1 结论  63
  6.2 后续研究工作  63-65
参考文献  65-71
缩略词表  71-73
致谢  73-75
发表论文与参加的研究课题  75
  发表文章  75
  参加的研究课题  75

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