学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

炭疽杆菌GNMT和GalE蛋白表达、纯化和结晶研究

作　者: 韩威超
导　师: 黄小红; 吴允昆
学　校: 福建农林大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 炭疽杆菌甲基转移酶 UDP-半乳糖-4-差向异构酶表达结晶
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

炭疽属于造成死亡率很高的一类急性的人畜共患传染病。炭疽杆菌常常被用作生化武器，对人类生存和生命安全存在威胁，因此炭疽杆菌的研究仍然是当今世界面临的一项重要课题。甘氨酸甲基转移酶（GNMT, EC2.1.1.20）是一种在自然界原核和真核生物中都丰富存在的酶，是氨基酸代谢途径中的关键酶，能催化甘氨酸引入甲基转化为肌氨酸，并调控机体内s-腺苷高半胱氨酸和肌氨酸的比率，在生物体内发挥着重要的作用；目前为止，甘氨酸甲基转移酶的晶体结构只有人和鼠的被解析出来，对其他物种的GNMT结构还不了解不足，因此对炭疽杆菌的该酶晶体结构进行研究，能够使我们更全面、更深入的了解该酶的功能和作用机制，为药物设计等应用提供基础。UDP-半乳糖-4-差向异构酶(GalE, EC5.1.3.2)是生命体内另一具重要功能的酶，同样广泛分布于各种各样的生物体内，它是葡萄糖与半乳糖之间转化的枢纽，在半乳糖的代谢中其着至关重要的作用；目前，GalE晶体结构已经通过从人、大肠杆菌、布氏锥虫等物种该酶蛋白组研究中获得，为人类揭开该酶功能和结构机理提供了钥匙，但是，不同的物种因其生存环境不同和自然的选择作用，其GalE结构存在或多或少差异，炭疽杆菌被人类看作一类高致病菌，研究其GalE结构并功能特点，可以使我们更加深入了解其功能发挥原理，为药物之新创和疾病之诊预提供方向。本文根据KEGG (the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Database中炭疽杆菌GNMT基因序列(登录号为BAS3318)和GalE基因序列（登录号为BAS1093），设计特异引物克隆获得其序列，其序列全长分别为1356bp和846bp，然后通过限制性内切酶双酶切后分别连接到表达载体pET-21a和pET-15b上，经过质粒PCR、双酶切及测序鉴定，筛选出阳性表达质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主菌成功构建了表达GNMT基因和GalE基因的重组载体工程菌，然后将其在IPTG诱导下进行表达，用镍亲和层析、Mono Q阴离子柱色谱和Sephacryl200（Sephacryl75）分子筛色谱对重组蛋白进行纯化，得到足量的适用于蛋白质结晶研究的融合蛋白，最后进行蛋白的结晶实验和晶体的条件优化筛选，得到了单晶样品，为GNMT高分辨率衍射单晶的获得提供借鉴，为GNMT、GalE晶体结构解析奠定基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 文献综述  12-24
  1.1 炭疽杆菌简介  12-16
    1.1.1 生物学特点  12-15
      1.1.1.1 炭疽杆菌病原菌的发现  12-13
      1.1.1.2 炭疽杆菌病原菌的生物学  13
      1.1.1.3 炭疽杆菌病原菌的致病性  13-14
      1.1.1.4 炭疽杆菌病原菌的免疫  14
      1.1.1.5 炭疽杆菌病原菌的检测  14-15
    1.1.2 炭疽病预防  15
    1.1.3 炭疽病症状及治疗  15-16
  1.2 甲基转移酶简介  16-19
    1.2.1 甲基转移酶的功能  16
    1.2.2 甲基转移酶的分类  16-17
    1.2.3 甲基转移酶的作用机制  17
    1.2.4 甲基转移酶的克隆表达  17
    1.2.5 甘氨酸甲基转移酶研究进展  17-19
      1.2.5.1 甘氨酸甲基转移酶的酶学特点  18
      1.2.5.2 甘氨酸甲基转移酶的功能  18
      1.2.5.3 甘氨酸甲基转移酶的结构研究  18-19
  1.3 异构酶简介  19-20
    1.3.1 异构酶的功能  19
    1.3.2 异构酶的分类  19
    1.3.3 异构酶的克隆表达  19-20
    1.3.4 异构酶的应用价值  20
  1.4 UDP-半乳糖-4-差向异构酶的作用机制  20-22
    1.4.1 UDP-半乳糖-4-差向异构酶结构研究  21-22
  1.5 本实验研究内容和意义  22-24
2 实验材料、仪器与方法  24-34
  2.1 材料与试剂  24
  2.2 仪器与设备  24-25
  2.3 实验方法  25-34
    2.3.1 PCR、产物鉴定、DNA 的回收  26-28
    2.3.2 质粒的抽提  28
    2.3.3 连接及菌落 PCR  28-29
    2.3.4 转化  29
    2.3.5 配制 LB 液体培养基和平板  29
    2.3.6 挑单菌落及扩大培养  29-30
    2.3.7 大肠杆菌中诱导表达  30
    2.3.8 镍柱重力洗脱纯化蛋白  30-31
    2.3.9 SDS-PAGE 电泳检测  31
    2.3.10 分子筛和离子交换柱层析操作步骤  31-32
    2.3.11 蛋白质浓度测定  32-33
    2.3.12 晶体生长  33-34
3 实验结果  34-49
  3.1 GNMT 基因 PCR 扩增  34-35
  3.2 GNMT 重组质粒鉴定  35-36
  3.3 GNMT 目的蛋白的表达检测  36-37
  3.4 GNMT 蛋白纯化  37-39
    3.4.1 Ni-NTA 亲和层析纯化  37
    3.4.2 Mono Q 离子交换层析柱纯化  37-38
    3.4.3 分子筛层析柱纯化  38-39
  3.5 蛋白质结晶  39-40
  3.6 结晶优化  40-42
  3.7 GalE 基因 PCR 扩增  42-43
  3.8 GalE 重组质粒鉴定  43-44
  3.9 GalE 目的蛋白的表达检测  44
  3.10 GalE 蛋白纯化  44-46
    3.10.1 Ni-NTA 亲和层析纯化  44
    3.10.2 Mono Q 离子交换层析柱纯化  44-45
    3.10.3 分子筛层析柱纯化  45-46
  3.11 GalE 蛋白质结晶  46-47
  3.12 GalE 结晶优化  47-49
4 讨论  49-53
  4.1 引物的设计与 PCR  49
  4.2 大肠杆菌克隆载体和表达载体  49-50
  4.3 重组质粒的双酶切鉴定  50
  4.4 重组蛋白的表达分离纯化  50-51
  4.5 蛋白晶体生长  51-53
5 结论  53-54
参考文献  54-60
致谢  60

炭疽杆菌GNMT和GalE蛋白表达、纯化和结晶研究

内容摘要

全文目录

相似论文