学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

减毒沙门氏菌介导的t-PA基因表达及生物学活性研究

作　者: 杨宁宁
导　师: 李银聚
学　校: 河南科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 减毒重组沙门氏菌 t-PA 表达质粒 BHK细胞小鼠
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 22次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，可作为活载体携带原核表达质粒和真核表达质粒，并能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。减毒沙门菌是异源抗原的优良载体，具有良好的侵袭力，能很好地定位于免疫组织器官中，被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。沙门氏菌自身具有纤溶酶原激活活性，这种活性与其侵染性有一定的关系。组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）是血管内皮细胞分泌的、具有特异激活血栓纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，能够特异地激活血栓纤维上结合的纤溶酶原转变成具有活性的纤溶酶，对于促纤溶活性引起体内弥漫性出血的风险性小。本研究利用减毒沙门氏菌细胞内侵袭特性和口服给药及肠壁吸收的优势，构建携带t-PA基因的重组减毒沙门氏菌，探讨减毒沙门氏菌作为活载体用于表达功能基因和预防心脑血管栓塞性疾病及其康复期治疗生物制剂的可行性。本实验根据人t-PA的编码序列设计3对引物，分别扩增t-PA目的基因片段，构建原核表达质粒pET28-tPA和PYA3494-tPA及真核表达质粒pcDNA₃-tPA。将重组质粒pET28-tPA和pcDNA₃-tPA分别经电转化导入减毒沙门氏菌ΔcrpSL1344，重组质粒PYA3493-tPA电转化减毒沙门氏菌ΔcrpΔasdSL1344，构建重组菌crpSL1344（pET28-tPA）、 crpSL1344（pcDNA₃-tPA）和crp asdSL1344（PYA3493-tPA）。重组菌分别转染体外培养的BHK细胞，SDS-PAGE检测t-PA表达情况，ELISA检测表达水平，纤维蛋白平板溶圈法检测纤溶活性；在此基础上，重组菌分别感染昆明白小鼠，Sysmex CA-50血凝仪检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）。实验结果显示，重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）、 ΔcrpSL1344（pET28-tPA）和ΔcrpSL1344（pcDNA₃-tPA）在BHK细胞中均有66kDa的蛋白表达，SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证明表达的目的蛋白为t-PA；转染96h的表达量分别为197μg/L、118μg/L和135μg/L，转染重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）的细胞裂解液和转染表达质粒的细胞培养上清均有促进溶解纤维蛋白的活性，转染真核重组菌ΔcrpSL1344（pcDNA₃-tPA）较原核重组菌ΔcrpSL1344（pET28-tPA）的蛋白活性高，且以重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）的活性最高。在凝血四项的检测中发现，4组实验组与对照组相比小鼠的PT、APTT、TT都有不同程度的延长；其中，转染重组菌ΔcrpΔasdSL1344（PYA3493-tPA）组小鼠PT、APTT、TT延长极显著（P<0.01），FIB的含量降低极显著（P<0.01）。研究表明，减毒沙门氏菌菌体具有促纤溶活性，携带t-PA原核和真核表达质粒的减毒沙门氏菌具有较强的促纤溶活性，真核细胞能够修饰原核载体表达的t-PA蛋白；携带PYA3493-tPA质粒的无抗性标记的asd宿主载体平衡致死系统，使t-PA基因稳定携带并高效表达。本实验为减毒沙门氏菌作为t-PA基因活载体和血栓性疾病的新型生物制剂的研究提供了新思路。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-10
第1章文献综述  10-20
  1.1 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展  10-13
    1.1.1 减毒沙门氏菌为载体的优点  10-11
    1.1.2 减毒沙门氏菌为载体的缺点及改进方法  11
    1.1.3 减毒沙门氏菌载体在国内的应用  11-12
    1.1.4 减毒沙门氏菌的稳定性表达  12-13
    1.1.5 沙门氏菌的纤溶活性  13
  1.2 t-PA 的研究进展  13-15
    1.2.1 t-PA 的结构特征与作用机制  13-14
    1.2.2 t-PA 的功能及应用  14-15
  1.3 利用转基因生物反应器生产 t-PA  15-17
    1.3.1 t-PA 在原核和真核细胞中的表达  15-16
    1.3.2 t-PA 在转基因生物反应器中的表达  16-17
  1.4 t-PA 对动物纤溶和凝血系统的作用  17-18
  1.5 研究目的与意义  18-20
第2章重组减毒沙门氏菌载体的构建与鉴定  20-37
  2.1 实验材料  20-25
    2.1.1 质粒和菌种及其培养条件  20-22
    2.1.2 工具酶和试剂  22-23
    2.1.3 主要试剂和培养基的配制  23-24
    2.1.4 PCR 引物的设计与合成  24
    2.1.5 主要实验器材  24
    2.1.6 DNA 分析软件  24-25
  2.2 试验方法  25-30
    2.2.1 pcDNA_3-tPA 真核表达载体的构建  25
    2.2.2 pET28-tPA 原核表达载体的构建  25-26
    2.2.3 PYA3493-tPA 原核表达载体的构建  26
    2.2.4 t-PA 基因的扩增、回收纯化、克隆  26-27
    2.2.5 连接产物的转化、质粒提取及鉴定  27-29
    2.2.6 重组减毒沙门氏菌的构建及鉴定  29-30
  2.3 结果与分析  30-35
    2.3.1 目的基因的克隆  30-31
    2.3.2 重组质粒的酶切鉴定  31-33
    2.3.3 重组菌的 PCR 鉴定  33-35
  2.4 讨论  35-37
第3章重组减毒沙门氏菌的体外表达与检测  37-48
  3.1 材料与试剂  37-39
    3.1.1 主要试验材料  37-38
    3.1.2 主要试剂  38
    3.1.3 主要溶液及配制方法  38-39
  3.2 实验方法  39-41
    3.2.1 重组菌 crpSL1344(pET28-tPA)诱导表达  39
    3.2.2 重组菌减毒沙门氏菌的稳定性  39-40
    3.2.3 BHK 细胞的复苏与体外培养  40
    3.2.4 细胞计数  40
    3.2.5 BHK 细胞的转染  40
    3.2.6 BHK 中表达产物的 SDS-PAGE 电泳与 Western blotting 检测  40-41
    3.2.7 BHK 表达产物的 ELISA 检测  41
    3.2.8 BHK 表达产物的琼脂糖平板溶圈法检测  41
  3.3 结果与分析  41-46
    3.3.1 重组菌的稳定性  41-42
    3.3.2 感染细胞后的形态学变化  42-43
    3.3.3 SDS-PAGE 电泳与 Western blotting 鉴定  43-44
    3.3.4 表达产物的 ELISA 检测  44-45
    3.3.5 表达产物的活性检测结果  45-46
  3.4 讨论  46-48
第4章携带 t-PA 基因的重组减毒沙门氏菌在小鼠体内表达与活性检测  48-55
  4.1 材料  48-50
    4.1.1 菌种  48-49
    4.1.2 实验动物  49
    4.1.3 试剂  49
    4.1.4 主要仪器  49-50
  4.2 方法  50-52
    4.2.1 实验动物分组与设计  50
    4.2.2 菌液的制备  50
    4.2.3 t-PA 活性的测定  50
    4.2.4 小鼠抗凝血模型的建立  50-51
    4.2.5 样本处理要求及检测方法  51
    4.2.6 检测指标及方法  51-52
    4.2.7 数据处理  52
  4.3 结果与分析  52-53
    4.3.1 3 种重组减毒沙门氏菌的活性  52
    4.3.2 重组菌对小鼠体内抗凝血模型的作用  52-53
  4.4 讨论  53-55
第5章结论  55-56
参考文献  56-61
致谢  61-63
攻读硕士学位期间的研究成果  63

减毒沙门氏菌介导的t-PA基因表达及生物学活性研究

内容摘要

全文目录

相似论文