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USP2a调控TCR介导的NF-κB激活的分子机制
作 者: 李轶
导 师: 舒红兵; 刘昱
学 校: 武汉大学
专 业: 细胞生物学
关键词: T细胞活化 USP2a MALT1 TRAF6 NF-κB
分类号: R392
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
NF-κB是免疫反应过程中调节基因表达的一个重要的转录因子。NF-KB不仅能被病原微生物的固有结构、多种细胞因子和各种压力刺激所激活,同样,也能被淋巴受体复合物识别的抗原所激活。成熟T细胞的完全活化依赖于T细胞受体复合物和由抗原呈递细胞所提供的CD28共同协作来完成。TCR/CD28共刺激诱导经典的NF-κB信号通路,这条通路是由IκB kinase复合物的活化来传递信号的。IKK复合物由两个有催化活性的亚基IKKα、IKKβ以及一个调节亚基IKKγ所组成。IKK复合物能催化IκBα磷酸化并进行蛋白酶体依赖的降解,从而将NF-κB二聚体释放出来,NF-κB二聚体转移至细胞核内结合在KB增强子元件上起始靶标基因的转录。在T细胞中,有三个至关重要的蛋白CARMA1(Caspase-recruitment domain membrane-associated guanylate kinase protein1)、BCL10(B-cell CLL-lymphoma10)和MALT1(Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene1)形成CBM信号体,这个信号体是介导TCR/CD28激活的早期信号向下游转导,从而激活NF-κB的关键桥梁。MALT1作为脚手架蛋白介导活化的CARMA1/BCL10与TRAF6相结合,通过促进TRAF6的E3泛素连接酶的活性来激活IKK复合物。此外,作为类半胱氨酸酶,MALT1拥有半胱氨酸酶的活性。一旦TCR通路激活,活化的MALT1能够切割去泛素化酶A20,从而抑制A20依赖的IKKγ(?)去泛素化,促进由TCR介导的NF-KB的激活。MALT1也能够切割BCL10,促进活化的T细胞进行整联蛋白介导的粘附。鉴于MALT1在由TCR介导的NF-κB激活过程中的关键作用,我们以MALT1作为钓饵用生化亲和纯化的方法来寻找可能参与调控MALT1功能的蛋白。在众多候选蛋白中,我们筛选出一个泛素特异蛋白酶USP2a(ubiquitin-specific protease2a),它能够特异地与MALT]相互作用,通过介导TRAF6与MALT1之间的相互作用来促进TCR介导的NF-κB (?)勺激活。我们的研究结果显示:首先,在Jurkat T细胞中下调USP2a的表达,抑制了由TCR介导的NF-κB的激活和IL-2的产生,而部分回复USP2a的表达量则NF-κB的激活相应回复。第二:在T细胞中,USP2a组成性地与TRAF6相结合,但是刺激依赖性地与MALT1、CARMA1动态结合。第三,TCR活化后,下调USP2a的表达显著地减弱了TRAF6与MALT1之间的相互用,并且¨MALT1和TRAF6的泛素化水平,尤其是K63位的泛素化水平严重降低。第四,在稳定表达USP2a-RNAi的HEK293细胞中回复USP2a的表达,过量表达的TRAF6与MALT1之间的相互作用增强。通过研究我们发现USP2a完整的蛋白酶活性也是它作为接头蛋白协助TRAF6被招募到MALT1所必需的。当下调USP2a的表达时,内源性TRAF6的SUMO化修饰水平明显相结合,这些结果表明USP2a持续性与TRAF6相结合,通过维持TRAF6的低SUMO化水平,使之在刺激情况下更易与MALT1(?)相互作用。我们的研究揭示了,USP2a在TCR信号通路中的发挥着正调控作用,为去泛素化酶参与去SUMO修饰过程提供了一个例子。该项研究增加了对泛素化修饰与SUMO化修饰之间联系的了解。
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全文目录
摘要 5-7 Abstract 7-12 1 研究背景 12-54 1.1 NF-κB及其在免疫反应中的作用 12-29 1.1.1 NF-κB信号通路 12-18 1.1.1.1 NF-κB家族成员及其调控机制 12-13 1.1.1.2 IκB家族成员及其调控机制 13-15 1.1.1.3 IκK家族成员及其调控机制 15-17 1.1.1.4 经典与非经典NF-κB信号通路 17-18 1.1.2 NF-κB在免疫过程中的作用 18-29 1.1.2.1 NF-κB与天然免疫 18-23 1.1.2.1.1 NF-κB与Toll样受体 18-20 1.1.2.1.2 NF-κB与胞质内DNA受体 20-21 1.1.2.1.3 NF-κB与NOD样受体(NLRs) 21-22 1.1.2.1.4 NF-κB与RIG-I样受体 22-23 1.1.2.2 NF-κB与炎症反应 23-24 1.1.2.3 NF-κB与适应性免疫 24-29 1.1.2.3.1 NF-κB与免疫细胞的发育成熟 25 1.1.2.3.2 NF-κB介导的T细胞的分化 25-28 1.1.2.3.3 NF-κB介导的B细胞的成熟 28-29 1.2 由抗原受体介导NF-κB激活的信号通路 29-44 1.2.1 TCR、BCR抗原受体介绍 29-30 1.2.2 TCR和BCR的近端信号元件 30-32 1.2.3 由TCR/CD28介导的NF-κB激活的信号通路 32-35 1.2.4 TCR通路中的关键分子 35-44 1.2.4.1 PKCθ及其调控机制 35-37 1.2.4.2 CARMA1及其调控机制 37-39 1.2.4.3 BCL10及其调控机制 39-41 1.2.4.4 MALT1及其调控机制 41-43 1.2.4.5 TRAF6及其调控机制 43-44 1.3 泛素化修饰与SUMO化修饰 44-54 1.3.1 泛素化修饰简介 44-45 1.3.2 泛素链类型 45-48 1.3.3 去泛素化酶 48-49 1.3.4 SUMO及SUMO修饰简介 49-51 1.3.5 去SUMO化修饰的蛋白酶 51-52 1.3.6 SUMO化的功能 52-53 1.3.7 泛素化与SUMO化修饰之间的关系 53-54 2 实验材料和实验方法 54-62 2.1 实验材料 54-56 2.1.1 细胞培养实验所需材料 54 2.1.2 构建表达载体所需试剂与材料 54-55 2.1.3 免疫共沉淀及Western Blot所需试剂与材料 55 2.1.4 实时定量PCR实验所需材料 55 2.1.5 双荧光素酶报告基因所需材料 55 2.1.6 串联亲和纯化所需载体与材料 55-56 2.1.7 流式分离细胞所需载体与材料 56 2.1.8 抗体及细胞因子 56 2.1.9 其他试剂及耗材 56 2.2 实验方法 56-62 2.2.1 质粒的构建与纯化 56-57 2.2.2 细胞的培养和瞬时转染 57 2.2.3 串联亲和纯化 57-58 2.2.4 逆转录病毒感染建立稳定表达的细胞系 58 2.2.5 免疫共沉淀和Western Blot实验 58-59 2.2.5.1 过表达外源蛋白免疫其沉淀实验 58-59 2.2.5.2 内源性蛋白免疫其沉淀 59 2.2.5.3 Western Blot实验 59 2.2.6 荧光定量PCR实验 59-60 2.2.7 ELISA实验 60 2.2.8 细胞的流式分选 60 2.2.9 泛素化实验与SUMO化实验 60-61 2.2.9.1 体内泛索化实验 60-61 2.2.9.2 SUMO化实验 61 2.2.10 荧光素酶报告基因实验 61-62 3 研究结果和讨论 62-79 3.1 研究背景与立项依据 62-63 3.2 研究结果与分析 63-76 3.2.1 MALT1相互作用蛋白的亲和纯化及质谱鉴定 63-64 3.2.2 USP2a是MALT1的相互作用蛋白 64-66 3.2.3 下调USP2a的表达抑制TCR诱导的NF-κB的激活 66-70 3.2.3.1 USP2a-RNAi载体的构建与效率检测 66-67 3.2.3.2 下调USP2a抑制IκBα的磷酸化 67-68 3.2.3.3 回复USP2a的表达可使IκBα的磷酸化水平恢复 68-69 3.2.3.4 下调USP2a抑制IL-2的产生 69-70 3.2.4 下调USP2a的表达抑制由TCR介导的MALT1以及TRAF6的多聚泛素化 70-71 3.2.5 USP2a介导TRAF6被招募至MALT1 71-74 3.2.5.1 下调USP2a的表达减弱了MALT1与TRAF6之间的相互作用 71-73 3.2.5.2 介导MALT1与TRAF6相互作用需要USP2a的酶活性 73-74 3.2.6 USP2a去除TRAF6上的SUMO化修饰 74-76 3.3 研究结果讨论与展望 76-79 参考文献 79-90 作者简历 90-92 缩略语标注表 92-94 致谢 94-95
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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