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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9（NS5ATP9）的表达分布及功能研究

作　者: 张海栋
导　师: 贾因棠; 赵龙凤; 成军
学　校: 山西医科大学
专　业: 感染病学
关键词: HCV NS5A NS5ATP9 表达分布实时荧光定量PCR 亚细胞定位表达谱基因芯片
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景和目的：NS5ATP9是抑制性消减杂交技术（SSH）筛选出的HCVNS5A蛋白反式激活基因。目前的研究表明NS5ATP9基因与多种肿瘤相关，其功能涉及DNA修复、细胞信号通路和细胞增殖的调控，但对于NS5ATP9在人体组织及一些细胞系中的表达及其细胞内定位的报道是不一致的。本实验中，我们从不同肝癌细胞系、细胞内定位及肝癌和癌旁组织多方面进行NS5ATP9表达与分布的研究，并应用基因芯片技术初步探讨NS5ATP9的功能。方法（：1）实时荧光定量RT-PCR技术和WesternBlot技术检测不同肝癌细胞系中NS5ATP9在mRNA水平上及蛋白水平上的表达差异（。2）实时荧光定量RT-PCR技术检测NS5ATP9在人肝癌和癌旁组织mRNA水平的表达差异。（3）线粒体标志蛋白重组载体pCMV-PDHA1-N-RFP、内质网标志蛋白重组载体pDsRED-N1-Calreticulin分别与pEGFP-N1-NS5ATP9重组质粒共转染HepG2细胞，激光共聚焦显微镜观察NS5ATP9蛋白的亚细胞定位。（4）pEGFP-N1-NS5ATP9重组质粒转染HepG2细胞，通过表达谱基因芯片了解NS5ATP9的生物学功能。结果：（1）NS5ATP9基因在Huh7、QYH7701、L02、SMMC7721和HepG2细胞系中的mRNA水平表达量分别是Bel7402细胞系的2.46、5.74、6.06、12.04和19.29倍。（2）NS5ATP9在肝癌组织中较癌旁组织均明显下调，5对试验样品下调的倍数分别为0.26、0.21、0.12、0.47、0.84倍。（3）细胞器标志蛋白重组载体与pEGFP-NS5ATP9重组质粒共转染HepG2细胞亚细胞定位结果表明，NS5ATP9主要分布在肝细胞核中。（4）NS5ATP9蛋白在不同细胞系Westernblot免疫印迹结果显示，NS5ATP9主要存在于细胞核中。（5）NS5ATP9表达谱基因芯片结果显示其调控的基因绝大多数与免疫应答和信号转导相关联，且绝大多数都位于细胞膜或与细胞膜相关联，已知功能基因绝大多数与离子通道活性和酶抑制剂活性相关联。结论：（1）NS5ATP9在在多种肝癌细胞系中mRNA水平上表达量较低，但比较而言以HepG2细胞系中最高。（2）NS5ATP9在肝组织中表达量较低，在肝癌中表达量明显下调，可能作为一个抑癌基因参与HCV的致癌机制。（3）激光共聚焦显微镜及细胞蛋白免疫印迹法显示，NS5ATP9细胞内定为主要位于在细胞核中。（4）NS5ATP9表达谱基因芯片结果提示，NS5ATP9生物学功能可能是通过调节膜蛋白上的离子通道活性和信号转导等机制来实现其对机体免疫应答的调节，这可能和HCV或一些肿瘤疾病的致病机制相关。

全文目录

英文缩略词  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-11
第一部分 NS5ATP9 在不同肝癌细胞系及人肝癌和癌旁组织中的表达  11-20
  材料与方法  11-16
  结果  16-19
  讨论  19-20
第二部分 NS5ATP9的亚细胞定位  20-27
  材料与方法  20-23
  结果  23-26
  讨论  26-27
第三部分 NS5ATP9过表达对肝癌细胞 H E P G 2 表达谱的影响  27-33
  材料与方法  27-29
  结果  29-32
  讨论  32-33
参考文献  33-36
综述  36-43
  参考文献  40-43
个人简历  43-44
致谢  44

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9（NS5ATP9）的表达分布及功能研究

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