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DEHP对小鼠睾丸发育的毒性-microRNA表达图谱的研究

作　者: Natalia Velásquez
导　师: 陆韻
学　校: 清华大学
专　业: 环境科学与工程
关键词: DEHP microRNA 基因芯片 RT-PCR 毒理基因组学生物信息学
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

近年来，环境中污染物质的种类和数量的增加逐渐导致了越来越多健康问题的产生，包括生殖系统的异常。发育中的器官更加易于受到毒性物质的影响，这一现象引起人们的关注，因为雄性胎儿的生长过程中睾丸的正常发育对其成年期生殖系统的正常运行是非常关键的。睾丸癌和雄性不育的发病率的增加很可能是源于发育早期受到的干扰。邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）已被证实与发育系统的危害有关，许多动物模型的研究显示，DEHP的产前接触可以导致危害效应，然而危害产生的具体方式并不清楚。在本研究中，怀孕的母鼠被随机分为三个不同的实验组以及一个对照组，从怀孕的4.5日至17.5日，每日通过灌胃给药（60,175,500mg/kg），对照组则以同等体积的玉米油进行灌胃。在怀孕第18.5天，处死母鼠并取出胚胎进行下一步的分析。相比于对照组，胎儿的体重、雌雄比、吸收和死亡率并未发生显著的变化，然而，总的外部畸形有出现在最高的给药剂量组。对睾丸的组织学分析显示出明显的生殖母细胞的多核现象，且这种现象是依赖于剂量的，即随着给药剂量的增加，多核细胞中的核的数目随之增加。此外，对血清中睾酮的分析显示，两个较高的剂量组的睾酮浓度相较于对照组有明显的升高。以胎儿的睾丸miRNA表达作为新的检测终点，基因芯片分析结果显示，25个小鼠的miRNA与对照组相比在调节异常方面展示了统计学意义上明显的差异。我们以RT-PCR验证其中8个miRNA，其结果确认了其中三个，即miR-195, miR-185和miR-451，与对照组相比过量的表达。这些推定的miRNA终点在预测网站上进行搜索，并同时验证其有效终点。对这些预测并验证的终点进行功能和路径分析，结果表明，这些基因涉及到细胞周期的调节，细胞增殖及凋亡。这些结果与胚胎发育时睾丸中发生的细胞进程相一致，在这个期间，细胞周期受到严格的调控。因而，miR-195,miR-185和miR-451的过量表达可能与受到DEHP暴露后的毒性效应的发生和发展相关，通过影响发育中睾丸的不同细胞形态的增殖和分化过程。同时这些miRNA也可能作为毒性效应的生物标记。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-9
1. INTRODUCTION  9-39
  1.1 Background  9-13
  1.2 Effect of endocrine disruption on the male reproductive system  13-14
  1.3 DEHP as an environmental endocrine disruptor  14-28
    1.3.1 Introduction to DEHP  14-19
    1.3.2 Animal Studies  19-22
    1.3.3 Summary of DEHP effects (rat) from literature  22-23
    1.3.4 Non-human Primate Studies  23-24
    1.3.5 Human Studies  24-28
  1.4 Developmental toxicity testing: an important tool in human health risk assessment  28-31
  1.5 Toxicogenomics: a powerful instrument in toxicity testing  31-33
  1.6 MicroRNA-based toxicogenomics  33-37
    1.6.1 Role of miRNAs in the testes  35-37
  1.7 Purpose and methodology of this study  37-39
    1.7.1 Purpose and objectives  37-38
    1.7.2 Methodology  38-39
2. MATERIALS AND METHODS  39-52
  2.1 Test compounds  39
  2.2 Preparation of animals  39
  2.3 Dose selection and administration of chemicals  39-40
  2.4 Isolation of gonads from fetuses at necropsy  40-41
  2.5 Serum testosterone analysis  41-44
  2.6 Histopathological analysis of the testis  44-46
  2.7 miRNA expression changes determined by Microarray  46-49
    2.7.1 RNA Extraction  46
    2.7.2 MicroRNA profiling through microarray  46-49
  2.8 miRNAs expression changes corroborated by QRT-PCR  49-50
  2.9 Target prediction  50-51
  2.10 Statistical Analysis  51-52
3. RESULTS  52-70
  3.1 Observations from pregnant females and fetuses at necropsy  52-56
  3.2 Fetal serum testosterone concentration  56-57
  3.3 Histopathology of the fetal testis  57-60
  3.4 miRNA expression changes determined by microarray  60-61
  3.5 Target prediction  61-62
  3.6 Analysis of selected miRNAs by qRT-PCR  62-65
  3.7 Analysis of validated targets  65-70
4. DISCUSSION  70-84
  4.1 Affinity with results from previous studies  70-74
    4.1.1 External evaluation of fetuses  70-71
    4.1.2 Testosterone assessment comparison  71-74
    4.1.3 Histopathological evaluation of testes  74
  4.2 Microarray and PCR analysis of dysregulated miRNAs and target prediction  74-77
    4.2.1 miR-195  75-76
    4.2.2 miR-185  76-77
    4.2.3 miR-451  77
  4.3 Target pathway analysis  77-81
  4.4 Relevance of findings from target analysis  81-84
5. CONCLUSIONS  84-87
  5.1 Summary and Conclusions  84-85
  5.2 Suggestions for further investigation  85-87
6. REFERENCES  87-98
7. ACKNOWLEDGEMENTS  98-99
8 APPENDIX  99-104
Curriculum vitae  104

DEHP对小鼠睾丸发育的毒性-microRNA表达图谱的研究

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