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纤维素酶分泌表达及纤维素一步发酵初步研究

作　者: 刘洋
导　师: 江正兵
学　校: 湖北大学
专　业: 微生物学
关键词: 纤维素纤维素酶分泌表达发酵乙醇甘油
分类号: TQ923
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

天然纤维素生物质在自然界中广泛存在,且含量丰富。利用纤维素为原料进行工业化生产生物乙醇是新能源领域的一大趋势,也是甘油生产的重要途径,在食品,医药,轻工等多个领域具有广泛应用。如何更为有效地利用纤维素是当前亟待解决的问题。本研究构建了以rDNA为介导的整合型分泌表达载体,将外源纤维素酶基因分别导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Y33。将来源于嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维素外切葡聚糖酶基因(CBH, GeneBank:AY861348),人工合成的高效纤维素内切葡聚糖酶基因(EG, GeneBank:EU169241)和来源于泰国紫檀(Dalbergia cochinchinensis)的β-葡萄糖苷酶基因(BG, GeneBank:AF163097)连接在信号肽编码序列下游后,再分别与整合型表达载体pHBM368连接,得到重组质粒,将线性化的重组质粒DNA以化学方法分别转化进宿主菌酿酒酵母Y33。经过筛选,分别挑出含三种纤维素酶基因的重组子,在发酵培养基中以半乳糖诱导分别实现三种纤维素酶的分泌表达。当菌液OD600=2.0时,经DNS法测定在50℃条件下,每毫升粗酶液所分泌的外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分别为3.96U/mL,3.01U/mL,3.89U/mL。发酵实验选取廉价的玉米芯粉为天然纤维素来源,经初步预处理后加入发酵培养基作为唯一碳源。实验结果证明在外源纤维素酶基因表达后,玉米芯纤维素能够被有效利用。发酵过程中结合同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)和混合菌发酵法(mixed fermentation, MF),得到生物乙醇及甘油。经96小时发酵,在1L摇瓶的混合菌一步发酵中乙醇浓度达到2.02g/L,甘油浓度达到0.85g/L。相同条件下,放大到3L摇瓶水平,乙醇浓度为2.13g/L,甘油浓度为0.82g/L。相比原始菌株,重组菌株能有效利用纤维素进行一步发酵得到乙醇和甘油。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-10
主要符号表  10-11
第一章引言  11-20
  1. 纤维素酶简介  11-13
    1.1 纤维素酶的分类与酶学性质  11
    1.2 纤维素酶的功能及作用机制  11-12
    1.3 纤维素酶的应用现状  12-13
  2. 纤维素简介  13-17
    2.1 纤维素的分布与来源  13
    2.2 纤维素的特性与种类  13-14
    2.3 纤维素的功能与应用现状  14-16
      2.3.1 膳食纤维  14-15
      2.3.2 多聚合纤维素在医学上的应用  15
      2.3.3 纤维素在工业中的应用  15-16
    2.4 玉米芯纤维素的简介及应用  16-17
      2.4.1 玉米芯利用效率的提高  16-17
      2.4.2 玉米芯利用方法的多样性  17
  3. 本课题研究的目的及意义  17-20
第二章实验部分  20-50
  1. 实验材料及方法  20-29
    1.1 培养基  20
    1.2 主要缓冲液  20-21
    1.3 试剂和酶  21
    1.4 仪器和设备  21-22
    1.5 常用生物实验材料及其制备方法  22-25
      1.5.1 大肠杆菌化学法感受态细胞的制备及转化  22
      1.5.2 质粒DNA的抽提  22-23
      1.5.3 酿酒酵母化学法感受态细胞的制备及转化  23-24
      1.5.4 SDS-PAGE胶的制备  24
      1.5.5 质粒与菌株  24-25
    1.6 DNS法测酶活  25-26
      1.6.1 标准曲线的绘制  25-26
      1.6.2 酶活测定  26
    1.7 发酵产物产量的测定  26-29
      1.7.1 发酵产物中甘油浓度的测定  26-27
      1.7.2 发酵产物中乙醇浓度的测定  27-29
  2. 实验结果与讨论  29-48
    2.1 分泌表达载体pHBM368-CBH的构建  29-31
    2.2 分泌表达载体pHBM368-EG的构建  31-32
    2.3 分泌表达载体pHBM368-BG的构建  32-33
    2.4 分泌表达载体重组子的验证  33-34
    2.5 重组菌株Y33-CBH、Y33-EG及Y33-BG的验证  34-35
      2.5.1 重组菌株在CMC-MD平板上的活性验证  34
      2.5.2 外源基因诱导表达的SDS-PAGE验证  34-35
      2.5.3 外源纤维素酶酶活测定  35
    2.6 重组菌株Y33-CBH以玉米芯粉为唯一碳源的摇瓶发酵  35-38
      2.6.1 Y33-CBH在摇瓶发酵中生物量的测定  36-37
      2.6.2 Y33-CBH在摇瓶发酵中甘油浓度的测定  37
      2.6.3 Y33-CBH在摇瓶发酵中乙醇浓度的测定  37-38
    2.7 重组菌株Y33-EG以玉米芯粉为唯一碳源的摇瓶发酵  38-41
      2.7.1 Y33-EG摇瓶发酵中生物量的测定  38-39
      2.7.2 Y33-EG摇瓶发酵中甘油浓度的测定  39-40
      2.7.3 Y33-EG摇瓶发酵中乙醇浓度的测定  40-41
    2.8 重组菌株Y33-BG以玉米芯粉为唯一碳源的摇瓶发酵  41-44
      2.8.1 Y33-BG摇瓶发酵中生物量的测定  41-42
      2.8.2 Y33-BG摇瓶发酵中甘油浓度的测定  42-43
      2.8.3 Y33-BG摇瓶发酵中乙醇浓度的测定  43-44
    2.9 重组菌株Y33-CBH、Y33-EG及Y33-BG的混合菌发酵  44-47
      2.9.1 混合菌摇瓶发酵中生物量的测定  44-45
      2.9.2 混合菌摇瓶发酵中甘油浓度的测定  45-46
      2.9.3 混合菌摇瓶发酵中乙醇浓度的测定  46-47
    2.10 重组混合菌株的3L摇瓶放大发酵  47-48
  4. 结论与展望  48-50
    4.1 纤维素酶一步发酵对发酵产物产量的影响  48
    4.2 发酵培养基及培养条件的优化  48-49
    4.3 以玉米芯为原料进行一步发酵的可行性分析及前景  49-50
参考文献  50-54
附录  54-59
致谢  59

纤维素酶分泌表达及纤维素一步发酵初步研究

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