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紫红笛鲷Ⅱ型MHC的克隆、表达与进化分析

作　者: 王天燕
导　师: 蔡中华
学　校: 清华大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 克隆进化表达主要组织相溶性复合体紫红笛鲷
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要

主要组织相溶性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是适应性免疫系统的抗原呈递分子，最常见的MHC有两类，MHC I将内源性抗原呈递给CD8+T淋巴细胞，MHC Ⅱ则将外源性抗原呈递给CD4+T淋巴细胞。MHC Ⅱ的功能还包括免疫识别、抗原呈递、疾病抵抗、自身免疫、雌雄淘汰和配偶选择等。鱼类是具有适应性免疫的最原始脊椎动物，对鱼类MHC Ⅱ的研究将有助于我们了解获得性免疫系统的进化，有助于研究鱼类疾病的防治和抗病害经济物种的选育，近年来有多个硬骨鱼物种的MHC Ⅱ基因被克隆和鉴定。MHC Ⅱ在组织和器官中的表达也有研究，不过大多研究基于RNA水平，仅有极少数蛋白水平的研究，可见在蛋白水平对鱼类MHC Ⅱ的研究还不够深入。紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)是一种具有较高经济价值的海洋鱼类，我们克隆和鉴定了紫红笛鲷主要组织相溶性复合体MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ的全长cDNA，推导的MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ链与其它脊椎动物的MHC Ⅱ分子具有相同的保守核苷酸位点和二级结构。对MHC I和MHC Ⅱ的进化分析表明二者亲缘关系紧密，很可能是由同一祖先基因进化而来。课题还制备了紫红笛鲷MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ链的多克隆抗体，二者对紫红笛鲷头肾巨噬细胞能分别显示出各自的目标条带，且都在26kD左右，这与预测的紫红笛鲷MHC Ⅱα（24.21kD）和MHC Ⅱβ（26.23kD）成熟肽大小吻合。免疫印迹发现MHC Ⅱ在紫红笛鲷的胸腺、脾脏、头肾、鳃、头肾巨噬细胞和脾脏淋巴细胞有大量表达，表明它们是紫红笛鲷重要的抗原呈递器官和细胞。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第1章前言  8-14
  1.1 研究背景  8-14
    1.1.1 MHC 的种类和功能  8
    1.1.2 MHC Ⅰ 和 MHC Ⅱ 的分子结构  8-10
    1.1.3 MHC Ⅱ 抗原呈递过程  10-11
    1.1.4 MHC 基因的染色体定位  11
    1.1.5 MHC 的进化  11-12
    1.1.6 鱼类 MHC Ⅱ 的研究现状  12-13
    1.1.7 研究目的和意义  13-14
第2章实验材料  14-16
  2.1 主要实验试剂  14-15
  2.2 主要实验仪器  15
  2.3 实验动物  15-16
第3章实验方法  16-29
  3.1 紫红笛鲷 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ全长 CDNA 的克隆  16-19
    3.1.1 紫红笛鲷 RNA 的提取  16
    3.1.2 紫红笛鲷 cDNA 的合成  16-17
    3.1.3 PCR 扩增 MHC Ⅱα和 MHC Ⅱβ全长 cDNA  17-18
    3.1.4 DNA 片段和 pMD 18-T 载体的连接  18
    3.1.5 感受态细胞的制备  18-19
    3.1.6 连接产物转化感受态细胞  19
  3.2 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ表达载体的构建  19-21
    3.2.1 PCR 扩增 MHC Ⅱα和 MHC Ⅱβ部分开放阅读框  19-20
    3.2.2 PQE-30 质粒的提取和酶切  20-21
    3.2.3 MHC Ⅱα、MHC Ⅱβ酶切片段与 PQE-30 的连接  21
  3.3 重组蛋白表达和多克隆抗体的制备  21-25
    3.3.1 重组蛋白诱导表达时间的确定  21-22
    3.3.2 SDS-PAGE 蛋白电泳  22-23
    3.3.3 重组蛋白的大量表达  23
    3.3.4 包涵体纯化  23
    3.3.5 变性条件下纯化重组蛋白  23-24
    3.3.6 MHC Ⅱα和 MHC Ⅱβ多克隆抗体的制备  24-25
    3.3.7 多克隆抗体效价的检测  25
  3.4 MHC Ⅱ 在组织和细胞中的表达  25-28
    3.4.1 头肾巨噬细胞和脾脏淋巴细胞的分离  25-27
    3.4.2 外周血淋巴细胞（PBL）的分离  27
    3.4.3 蛋白样品的制备  27
    3.4.4 Western blot 检测  27-28
  3.5 生物信息类软件和方法  28-29
第4章 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ的克隆和进化分析  29-39
  4.1 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ全长 CDNA 序列  29-31
  4.2 BLAST 分析 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ序列相似性  31-33
  4.3 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ的聚类分析  33-35
  4.4 MHC Ⅱ 进化分析  35-39
    4.4.1 MHC Ⅱα和 MHC Ⅱβ和进化树构建  35-36
    4.4.2 MHC Ⅱ 和 MHC I 的进化树构建  36-39
第5章 MHC Ⅱ 重组蛋白表达和多克隆抗体的制备  39-43
  5.1 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ重组蛋白的表达与纯化  39-40
  5.2 紫红笛鲷 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ多克隆抗体效价检测  40-41
  5.3 MHC ⅡΑ和 MHC ⅡΒ多克隆抗体的免疫印迹检测  41-43
第6章 MHC ⅡΒ在紫红笛鲷组织和细胞中的表达分析  43-46
  6.1 MHC ⅡΒ在紫红笛鲷组织中的表达  43-45
  6.2 MHC Ⅱ 在紫红笛鲷头肾巨噬细胞和脾脏淋巴细胞中的表达  45-46
第7章结论  46-47
参考文献  47-51
致谢  51-53
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  53

紫红笛鲷Ⅱ型MHC的克隆、表达与进化分析

内容摘要

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