学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

两种蜘蛛的毒素基因克隆和表达

作　者: 李滨
导　师: 舒衡平; 蒋立平
学　校: 中南大学
专　业: 病原生物学
关键词: 蜘蛛 毒素 cDNA文库 多肽 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 31次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


研究背景当前,对蜘蛛毒素的生物功能及其作为药物先导分子在药理学研究中应用的探索,越来越受到天然药物开发研究者的重视。但是,天然毒液的产量较小这一问题,一直制约着其功能和活性的研究进展。为此,探索合成或者生产蜘蛛毒素的简便易行的方法,已经是当前该领域研究者亟待解决的问题。虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonus huwena）是分布在华南山区的一种体型较大的毒蜘蛛。目前已从其毒液中分离出多种蛋白质和多肽,并且已经鉴定部分蛋白质和多肽的生物活性。其中,多肽DkTx （double-knot toxin）可以通过刺激细胞膜外侧孔区域激活辣椒素受体和瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道,促进降钙素相关肽的释放,进而起到舒血管及降血压的作用。森林漏斗蛛（Agelena silvatica）是漏斗蛛科蜘蛛中,毒液毒性较小的蜘蛛,广泛分布在我国南北方的山林和草原地区,其可利用毒液麻痹昆虫进行捕食。目前,国内尚没有对该种蜘蛛的毒素研究,缺乏相关的数据,本研究将填补这些数据的空白。研究目的1、筛选DkTx的类似物,并进行功能分析。2、构建森林漏斗蛛毒腺的cDNA文库,筛选新的毒素基因。研究方法1、设计引物,在虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库中,通过PCR扩增出目的基因。将目的基因构建至表达载体pVT102U/α,利用酿酒酵母S-78株进行表达,并将表达产物分离纯化、鉴定。2、取森林漏斗蛛毒腺,利用CreatorTM SMARTTm cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库,设计引物,通过PCR扩增筛选新的毒素基因。研究结果1、在虎纹捕鸟蛛毒腺的cDNA文库中,成功筛选出4种DkTx类似物：FR+T3F34+P-5、FR+T3F34+P-6、FR+T5R32+P-8FR+T5R32+P-105。并通过酿酒酵母S-78株表达了DkTx类似物,其中FR+T5R32+P-8的氨基酸序列得以正确表达。2、通过构建cDNA文库,筛选出5种cDNA序列：D7、D82、D134、D523、D787。其中D7、D134、D523、D787为新的蜘蛛毒素基因；D82与Agelenopsis aperta的蜘蛛毒素Toxin7超家族的序列完全相同。结论1、成功筛选了4种DkTx的类似物,并通过酿酒酵母表达。2、通过构建森林漏斗蛛cDNA文库,成功克隆出4种新的毒素基因。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
英文缩略词表  10-11
前言  11-15
第一章 虎纹捕鸟蛛毒腺中DkTx类似物的基因克隆、酵母表达及鉴定  15-34
  1.1 材料与方法  15
    1.1.1 材料与试剂  15
  1.2 实验方法  15-25
    1.2.1 引物设计  15-16
    1.2.2 克隆目的基因片段  16
    1.2.3 PCR产物纯化  16-17
    1.2.4 双酶切  17
    1.2.5 酶切后纯化  17
    1.2.6 构建新的质粒  17-18
    1.2.7 转化进入感受态细胞  18-19
    1.2.8 菌落PCR  19
    1.2.9 进行琼脂糖凝胶电泳验证  19
    1.2.10 连接至表达质粒  19-22
    1.2.11 提取含有目的基因片段的质粒  22-23
    1.2.12 转化进入感受态细胞  23-25
  1.3 实验结果  25-32
    1.3.1 验证克隆的目的基因片段  25
    1.3.2 已转化目的基因的菌落的鉴定  25-26
    1.3.3 产物测序结果  26-28
    1.3.4 鉴定  28-32
  1.4 讨论  32-33
  1.5 结论及意义  33-34
第二章 森林漏斗蛛毒腺cDNA文库的构建  34-49
  2.1 材料与方法  34
    2.1.1 主要试剂和材料  34
  2.2 实验方法  34-37
    2.2.1 取森林漏斗蛛的毒腺  34
    2.2.2 提取毒腺的总RNA  34
    2.2.3 毒腺cDNA文库的构建  34-36
    2.2.4 鉴定连接到文库载体  36
    2.2.5 电转化  36
    2.2.6 克隆目的基因片段  36-37
    2.2.7 凝胶电泳筛选并送测序  37
  2.3 实验结果  37-47
    2.3.1 森林漏斗蛛鉴定  37-38
    2.3.2 总RNA的鉴定  38
    2.3.3 长距离PCR产物的鉴定  38-39
    2.3.4 菌落PCR鉴定cDNA文库  39-40
    2.3.5 文库序列分析  40
    2.3.6 初步生物信息学分析  40-47
  2.4 讨论  47-48
  2.5 结论及意义  48-49
参考文献  49-53
综述 蜘蛛毒素人工表达的研究进展  53-67
  参考文献  61-67
致谢  67-68
攻读学位期间主要的研究成果  68

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 高校艺术教学建筑设计研究,TU244.3
  3. 时间表达式识别与归一化研究,TP391.1
  4. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  6. 拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究,Q945.78
  7. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  8. 壳聚糖及其衍生物脱除牡蛎中麻痹性贝类毒素的研究,TS254.4
  9. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  10. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  11. 《庄子》修辞策略探析,B223.5
  12. 铝胁迫下小黑豆的红外光谱特征分析及其铝胁迫响应基因的鉴定,S529
  13. 葡萄籽原花青素制备工艺及真菌毒素检测,TQ461
  14. 鬼臼毒素衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究,R284
  15. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  16. 乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克小鼠的治疗效应及其机理研究,R459.7
  17. N-氨甲酰谷氨酸合成及其生理功能研究,R914
  18. Bt毒素寡聚体形成与脂筏的关系以及钙粘蛋白的免疫检测技术探索,S476.1
  19. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  20. 弱光胁迫及光恢复对玉米幼苗生长发育及差异蛋白组分析,S513
  21. 烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析,Q943.2

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com