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神经干细胞的分化影响其对SDF-1α的趋化性应答

作　者: 陈叶冰
导　师: 张焕相
学　校: 苏州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 神经干细胞细胞分化细胞迁移 SDF-1α
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）通过不断分裂增殖以维持自身稳定，并可分化成神经系统中所有种类的神经细胞，此外还具有高效迁移特性。在胚胎期的神经系统发育过程中，NSCs自脑室侧壁（lateral ventricle, LV）不断迁移至特定区域形成具有特定功能组织，进而构建出复杂的中枢神经系统（central nerve system,CNS），而NSCs的迁移缺陷则会导致许多神经退行性疾病；存在于成年大脑侧脑室外侧壁（subventricular zone, SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus, DG）区域中的NSCs可定向迁移至分子颗粒层和嗅球（olfactory bulb, OB）等神经发生部位，参与神经组织的形成；最近有研究报道，NSCs还可朝向病灶位点做趋化性迁移，NSCs的这一特性给治疗神经损伤性疾病带来希望。因此，针对NSCs定向迁移机制的研究十分有必要。有研究报道，大脑损伤区域以及病灶位点分泌多种细胞生长因子、趋化因子以及炎症因子。基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor, SDF-1α）是研究最为广泛的趋化因子之一，它通过与其专一性受体CXCR4结合，激活下游一系列信号通路。其中，PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与调节SDF-1α诱导的NSCs的定向迁移。NSCs的迁移受到多种因素的综合调节，除了细胞外因子对其有促进或抑制作用，在特定环境中，还受到细胞自身状态的影响。有研究发现，具有初步分化特征的神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）展现出趋化性迁移能力，如：DCX或PSA-NCAM阳性的神经元前体细胞和表达A2B5的少突胶质细胞前体细胞，而未分化的NSCs（高表达干细胞标记物nestin）迁移能力相对低下，大部分停留在初始点。我们猜测处于特定分化阶段的NSCs具有更强趋化性迁移能力。为了验证这一假设，我们选用了来源于小鼠小脑皮层的神经干细胞系C17.2，对其进行分化诱导得到不同分化状态的NSCs并进行表型鉴定；利用Boyden chamber和Dunn chamber趋化性迁移装置检测不同分化状态的NSCs对SDF-1α的趋化性应答差异；通过探测肌动蛋白微丝F-actin的组装与聚合，对不同分化状态的NSCs中细胞骨架的重组频率和微丝的排列分布进行比较；为了进一步探索NSCs迁移与细胞分化状态之间的关系，我们随后在分子水平上研究与迁移分化相关联的内在机制。运用Western blot技术对细胞内涉及迁移的信号通路如PI3K/Akt和MAPKs蛋白家族信号通路（ERK1/2、SAPK/JNK、p38MAPK信号通路）的激活水平进行检测，分析了在不同分化状态NSCs中这些信号通路对SDF-1α刺激的应答差异；最后，利用特异性抑制剂将上述信号通路分别阻断，通过趋化性迁移实验检测了不同分化状态NSCs的迁移变化。综合上述实验，我们主要得到了以下结果：1. NSCs向SDF-1α的趋化性迁移能力受分化状态的影响：在Boyden chamber趋化迁移实验中，不同分化状态的NSCs在5ng/ml SDF-1α的诱导下，迁移至下室的细胞数目不同，分化0.5天和1天的NSCs对SDF-1α应答能力最强；同时，分化0天、0.5天和1天的NSCs出现最大迁移数目的SDF-1α浓度为5ng/ml，而分化3天NSCs对应的最佳迁移浓度为50ng/ml，说明不同分化状态的NSCs对SDF-1α敏感程度不同。2.特定分化阶段的NSCs拥有较强细胞趋化性迁移能力。细胞的迁移速度和迁移效率是构成迁移的基础要素，两者相互独立，受到不同信号通路的调控。在NSCs的不同分化状态下，NSCs具有不同的运动活性。分化0.5天和1天的NSCs随机迁移速度比其他分化状态的NSCs快。同时它们对SDF-1α的响应能力也因分化状态的不同而发生改变；在25ng/ml SDF-1α浓度梯度中，分化1天的NSCs迁移方向性效率最高，并且具有最大迁移速度。3. SDF-1α刺激后，不同分化状态的NSCs中微丝聚集以及细胞骨架重组频率不同。未分化的NSCs在5ng/ml的SDF-1α处理30min后细胞边缘出现大量富含F-actin的片状伪足，分化0.5天和分化1天NSCs中片状伪足出现在5ng/ml的SDF-1α刺激15min左右，而分化3天的NSCs细胞边缘在同样刺激下未出现类似伪足结构。4.不同分化状态的NSCs中，PI3K/Akt和MAPKs信号通路对SDF-1α的应答水平不同。在5ng/ml的SDF-1α刺激不同时间段（0、5、15、30、60min）或不同浓度SDF-1α（0、5、25、50、100ng/ml）处理30min后，在不同分化状态NSCs中PI3K/Akt和MAPKs信号通路的激活状态所对应的SDF-1α浓度、SDF-1α刺激时间段以及活性持续时间均不相同。5. PI3K/Akt和MAPKs对不同分化状态的NSCs趋化性迁移发挥的调节作用各不相同。已证明细胞的群体趋化性迁移、迁移速度和迁移效率都与细胞所处的分化状态密切相关的，与迁移相关的信号通路在不同分化阶段的细胞中发挥不同程度的调节作用，说明细胞的分化状态可以改变信号通路在细胞中的激活水平，进而改变细胞内部调控细胞迁移行为的分子机制，最终引起细胞趋化性迁移行为的改变，在分子水平上对细胞分化状态影响迁移能力做了初步解释。本研究为提高NSCs移植临床治疗手段成功率提供新思路，首次将干细胞分化状态对迁移的影响纳入研究范围，为寻找更稳定高效的治疗途径提供广阔的视野。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-10
序言  10-14
材料与方法  14-21
结果  21-35
讨论  35-40
结论  40-42
综述  42-60
参考文献  60-66
缩略词表（Abbreviation）  66-68
攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文  68-69
本研究所获基金资助  69-70
致谢  70-71

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