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MyoX与N-Cadherin相互作用影响促性腺激素释放激素神经元的迁移

作　者: 苑琳
导　师: 朱筱娟
学　校: 东北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 细胞迁移细胞粘附细胞极性 Myo X GnRH神经细胞 N-Cadherin
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

于鼻间隔嗅基板区域,沿着犁鼻神经纤维迁移到筛板,然后穿过筛板绕过嗅球,最终迁移至前脑部位分泌GnRH激素。这种激素是生殖轴重要的脑部调节因子,在调节垂体-性腺轴的功能中发挥着很关键的作用。因此GnRH神经细胞迁移至正确位置,对脊椎动物生殖系统的发育及生殖功能的发挥非常重要。Myo X(Myosin X)分子作为一种非传统形式的肌球蛋白,在丝足形成、细胞迁移、细胞粘附及极性建立等过程中都发挥着重要作用。实验室前期工作已经证明沉默Myo X的表达会引起细胞极性的丧失。已有研究表明Myo X通过FERM结构域与血管内皮细胞钙粘附蛋白(VE-Cadherin)相互作用,携带VE-Cadherin沿着丝足运动,从而促进早期细胞间连接的建立。N-Cadherin是跨膜糖蛋白的钙粘素家族的重要成员之一,与VE-Cadherin具有高度的同源性。N-Cadherin是表达于神经系统的钙粘附蛋白,推测N-Cadherin可能具有与VE-Cadherin相似的功能,通过与Myo X相互作用,在神经细胞粘附形成和极性建立中发挥着重要作用。实验中通过免疫共沉淀证明Myo X可通过尾部区与N-Cadherin相互作用;然后沉默Myo X在NLT细胞系中的表达,导致细胞粘着斑密度由0.097±0.00021个/μm2降低密度为0.052±0.00017个/μm2;利用‘stick and wash’方法也检测到细胞与基质间粘附能力降低;同时F-actin的密度也由0.0043±0.00012个/μm2降低为0.0027±0.00015个/μm2,说明细胞骨架的稳定性受到影响;通过Real time PCR分析发现,沉默Myo X导致N-Cadherin的转录水平下降为正常水平的52.40%,Western blot分析表明蛋白表达也受到抑制;细胞团分析表明,正常情况下,细胞团周围细胞迁移总数和辐射状迁移细胞数目分别为117±20.5841个和115±20.4134个,而Myo X沉默后,迁移总数和辐射状迁移细胞分别降为94±13.6651个和90±13.3416个,N-Cadherin的过表达又分别使之提高为111±14.3858个和109±14.5428个;同时Myo X也影响细胞迁移距离,沉默Myo X使细胞团周围细胞的平均迁移距离由正常水平的158±15.7011μm降低为109±36.1012μm,而过表达N-Cadherin使细胞平均迁移距离恢复为170±10.3982μm。总之,结果表明Myo X与N-Cadherin相互作用,调节GnRH神经细胞的正确迁移,为进一步阐明GnRH神经细胞迁移机制提供了一些理论依据。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 引言  8-14
  1.1 GnRH 神经细胞的作用及迁移路径  8
  1.2 影响 GnRH 神经细胞迁移的因素  8-10
  1.3 钙粘素(Cadherin)家族  10-11
    1.3.1 Cadherin 分子参与细胞粘附  10
    1.3.2 N-Cadherin 可能与细胞极性有关  10-11
    1.3.3 N-Cadherin 参与细胞的迁移  11
    1.3.4 Cadherin 分子参与 Wnt 信号传导通路  11
  1.4 肌球蛋白家族  11-13
    1.4.1 Myo X 的结构  12
    1.4.2 Myo X 对于丝足的形成和延伸以及丝足内的物质运输起到关键作用  12
    1.4.3 Myo X 参与信号传导过程  12-13
    1.4.4 Myo X 对于细胞间粘附的形成及细胞迁移起着重要的作用  13
  1.5 立题依据  13-14
2 材料和方法  14-22
  2.1 动物材料和细胞株  14
  2.2 质粒和引物  14
  2.3 化学试剂  14-15
  2.4 抗体  15
  2.5 仪器  15
  2.6 Myo X -SiRNA 与Scramble miRNA 质粒大提  15-16
  2.7 Myo X -SiRNA 与Scramble miRNA 质粒电转NLT 细胞  16
  2.8 细胞蛋白提取液RIPA 缓冲液的配制  16-17
  2.9 质粒转化及细胞蛋白抽提  17
  2.10 Western blot 分析  17-18
  2.11 免疫共沉淀  18
  2.12 免疫荧光检测Myo X -SiRNA 过表达对粘着斑和细胞骨架的影响  18
  2.13 细胞与基质间粘附的测定  18-19
  2.14 细胞总RNA 的提取和实时荧光定量PCR  19-20
    2.14.1 细胞总RNA 的提取  19
    2.14.2 去除DNA 污染  19
    2.14.3 逆转录合成cDNA  19-20
    2.14.4 real-time PCR 以检测Myo X -SiRNA 过表达对NCAM 和N-Cadherin 表达的影响  20
    2.14.5 real-time PCR 数据处理及统计学分析  20
  2.15 鼠尾胶原的制备  20-21
  2.16 细胞团的制备与培养  21
  2.17 胶原凝胶包埋细胞团  21-22
3 结果与分析  22-27
  3.1 Myo X 与N-Cadherin 相互作用  22
  3.2 沉默Myo X 降低细胞粘附  22-23
  3.3 沉默Myo X 降低细胞骨架的稳定性  23-24
  3.4 沉默Myo X 导致N-Cadherin 转录与表达的下调  24-25
  3.5 N-Cadherin 的过表达补救 Myo X Knockdown 引起的细胞迁移能力减低  25-27
4 讨论  27-29
5 结论  29-30
参考文献  30-33
致谢  33

MyoX与N-Cadherin相互作用影响促性腺激素释放激素神经元的迁移

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