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靶向Lingo-1的脊髓损伤实验治疗学研究

作　者: 张永杰
导　师: 王鹤鸣；Christopher B.Shields
学　校: 南京医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 脊髓损伤 神经元 少突胶质细胞 轴突退行性变 脱髓鞘 Lingo-1 脱髓鞘病变 髓鞘再生 溶血卵磷脂 Lingo-1 KO小鼠 脊髓横断 轴突再生 抗Lingo-1抗体
分类号: R651.2
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一部分脊髓损伤后Lingo-1的表达变化脊髓损伤后,存在神经元轴突退行性变、少突胶质细胞凋亡或死亡导致的脱髓鞘病变等继发性病理损害和功能障碍,但其确切的分子机制尚未完全阐明。最近研究发现Lingo-1特异性的表达在中枢神经系统(CNS)的神经元和少突胶质细胞上,且抑制轴突再生和少突胶质细胞的分化与髓鞘化,提示其参与了脊髓损伤后轴突变性与脱髓鞘过程。本实验中,我们运用实时定量逆转录PCR和Western Blot分别检测Lingo-1在小鼠溶血卵磷脂注射诱导脊髓脱髓鞘和脊髓背侧横断后动态表达变化。结果显示Lingo-1mRNA在脊髓脱髓鞘病变后1天和3天明显增高,在脊髓背横切术后1,3,14,28天表达上调。Western Blot也证实两种模型鼠的Lingo-1蛋白在脊髓损伤后表达上调。上述结果提示Lingo-1参与了脊髓损伤早期的病理生理过程。第二部分抑制Lingo-1可促进脱髓鞘病变小鼠脊髓轴突髓鞘再生寻找促进轴突髓鞘再生的新方法是治疗中枢神经系统脱髓鞘病变的一项重要策略。已有实验证明Lingo-1对少突胶质细胞的分化和髓鞘形成起负性调控作用。本实验中,我们通过注射1%溶血卵磷脂至小鼠脊髓腹外侧区(VLF)制作小鼠脱髓鞘模型;采用Lingo-1基因敲除小鼠,或对C5781/6小鼠腹腔注射抗-Lingo-1抗体的方法阻断Lingo-1信号,以研究Lingo-1阻断后对轴突的髓鞘再生和tcMMEP(经颅磁刺激运动诱发电位)重建的促进作用。形态学观察显示接受溶血卵磷脂注射2周和4周后,Lingo-1基因敲除小鼠及抗-Lingo-1抗体注射小鼠其脱髓鞘病变区面积变小,髓鞘再生的轴突数目变多,电镜及G-ratio测量均证实其再生髓鞘的厚度增加;而且,其tcMMEP恢复比对照组更佳,表明VLF区脱髓鞘病变轴突的传导功能因髓鞘再生而得到了更好的恢复。上述结果提示在CNS脱髓鞘病变中阻断Lingo-1信号可以促进髓鞘再生和电生理功能的恢复,抗-Lingo-1抗体可作为一种有效的治疗药物用于CNS脱髓鞘病变的治疗。第三部分抗Lingo-1抗体可促进小鼠脊髓损伤后CST轴突再生及功能恢复脊髓损伤后,髓鞘源性轴突生长抑制因子,包括MAG、NogoA和OMgp,通过与分布在轴突生长锥表面的Nogo受体(NgR1)复合物结合,产生抑制轴突再生的功能。NgR复合物由NgR1/Lingo-1/P75或TROY(TAJ)组成。Lingo-1是一富含亮氨酸重复序列的跨膜蛋白,可将抑制轴突生长的信号跨膜传导至胞内激活RhoA途径,最终抑制轴突再生。已有实验证明鞘内注射可溶性Lingo-1(Lingo-1-Fc片段)至脊髓损伤局部,可促进红核脊髓束(RST)及皮质脊髓束(CST)的轴突再生,并改善动物运动功能恢复。本实验中,我们通过腹腔注射抗Lingo-1抗体,观察在脊髓背横断术后,BDA标记的CST轴突和霍乱毒素B亚单位(CTB)标记的上行感觉纤维的再生状况。结果显示抗Lingo-1抗体治疗可促进CST轴突再生并改善运动功能的恢复,同时能抑制CTB标记的上行感觉纤维萎缩。提示抗Lingo-1抗体可作为一种新的药物用于SCI的研究和治疗。

全文目录


缩写词  4-7
第一部分 脊髓损伤后Lingo-1的表达变化  7-29
  中文摘要  7-8
  英文摘要  8-9
  引言  9-13
  材料与方法  13-23
    1.材料  13-15
    2.方法  15-23
      2.1.手术  15-16
      2.2.实时荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)实验  16-20
      2.3.蛋白印迹(Western Blot)试验  20-22
      2.4.统计学分析  22-23
  结果  23-26
    1.小鼠脱髓鞘病变后Lingo-1的表达变化  23
    2.小鼠脊髓背横断后Lingo-1的表达变化  23-26
  讨论  26-29
第二部分 抑制Lingo-1可促进脱髓鞘病变小鼠脊髓轴突髓鞘再生  29-51
  中文摘要  29-30
  英文摘要  30-31
  引言  31-33
  材料与方法  33-37
    1.实验动物与分组  33
    2.制作脱髓鞘模型  33
    3.抗Lingo-1抗体治疗  33
    4.电生理学测试(tcMMEP)  33-34
    5.组织准备,甲苯胺蓝染色和电镜观察  34-35
    6.组织学分析  35-36
    7.统计学分析  36-37
  结果  37-48
    1.Lingo-1-基因敲除促进小鼠脊髓脱髓鞘病变后髓鞘再生  37-43
    2.抗Lingo-1抗体治疗促进脱髓鞘病变小鼠髓鞘再生  43-48
  讨论  48-51
第三部分 抗Lingo-1抗体可促进小鼠脊髓损伤后CST轴突再生及功能恢复  51-72
  中文摘要  51-52
  英文摘要  52-53
  引言  53-55
  材料与方法  55-61
    1.实验动物  55
    2.实验流程设计  55
    3.小鼠脊髓背横断手术  55
    4.抗Lingo-1抗体治疗  55
    5.生物素化葡聚糖胺(BDA)标记CST传导束  55-56
    6.霍乱毒素B亚单位(CTB)标记上行感觉传导束  56
    7.行为学测试  56-57
    8.组织准备  57-58
    9.免疫组织化学和免疫荧光组织化学染色  58-59
    10.组织学分析与细胞计数  59-60
    11.统计学分析  60-61
  结果  61-69
    1.抗Lingo-1抗体治疗促进动物运动功能恢复  61-62
    2.抗Lingo-1抗体治疗促进CST轴突再生  62
    3.抗Lingo-1抗体抑制CTB标记的感觉神经纤维退缩(die back)  62-69
  讨论  69-72
小结  72-73
参考文献  73-83
附录  83-86
致谢  86-88
综述及参考文献  88-100

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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