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Fe_3O_4-葡聚糖—抗βHCG抗体磁性纳米载体介导的乙酰肝素酶反义寡核苷酸对绒毛膜癌抑制作用研究

作　者: 蔡净亭
导　师: 胡铁辉；张怡
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 乙酰肝素酶 绒毛膜癌 侵袭能力 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物 靶向性 基因载体 侵袭力
分类号: R737.33
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一章乙酰肝素酶与绒毛膜癌浸润转移关系的实验研究目的:通过研究乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）mRNA和蛋白质在人绒毛膜癌（chriocarcinoma,绒癌）高低转移细胞株及人正常早孕绒毛组织中的表达情况,探讨Hpa的表达与绒癌侵袭能力的关系。方法:（1）应用MTT和Matrigel体外侵袭试验检测不同人绒癌细胞系JEG-3与JAR之间增殖能力和侵袭能力的差异;（2）应用RT-PCR和Western-blot技术检测Hpa mRNA和蛋白质在人正常早孕绒毛组织、不同侵袭力人绒癌细胞株中的表达情况及差异;（3）应用免疫化学方法检测Hpa在各组织和细胞中的定位情况。结果:（1）JEG-3和JAR细胞之间增殖能力的差异无显著性（P＞0.05）,但JEG-3细胞的侵袭能力显著高于JAR细胞（P＜0.05）;（2）人绒癌细胞株中Hpa mRNA和蛋白质的表达量显著高于人正常早孕绒毛组织,而具有高侵袭性JEG-3细胞中Hpa mRNA和蛋白质的表达量又明显高于JAR细胞,差异均具有显著性（P＜0.05）;（3）Hpa在人正常早孕绒毛组织和绒癌细胞中均主要定位于胞浆;（4）相关性分析显示Hpa mRNA和蛋白质表达水平与绒癌细胞侵袭力之间成正相关。结论:绒癌的侵袭能力与Hpa有关。第二章Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的制备及其相关性质的研究目的:采用化学共沉淀法制得Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物,并以此为载体,以Hpa AS-ODN基因作为靶基因,来评价该磁性纳米颗粒作为基因载体的可行性。方法:（1）采用化学共沉淀法制备Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物,使用透射电镜、激光粒度检测仪和原子吸收光谱分析仪检测该纳米颗粒的形态、粒径和铁的含量;（2）MTT法检测该纳米颗粒的细胞毒性;（3）ELISA法和间接免疫荧光法鉴定该纳米颗粒的免疫特性;（4）采用琼脂糖凝胶电泳分析该纳米颗粒基因结合能力及抵抗DNase I消化的能力;（5）流式细胞仪鉴定该纳米颗粒的基因转染效率以及不同细胞对该纳米颗粒的摄入情况;（6）原子吸收光谱分析仪测定该纳米颗粒在绒癌成瘤裸鼠体内的分布情况。结果:（1）Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米颗粒大小均匀,形状不规则,其平均粒径为75.5nm,溶液中Fe3+的浓度约为375ug/ml;（2）当Fe3+的终浓度小于37.5ug/ml（培养液中含有10%Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物）时,该纳米颗粒具有良好的生物相容性;（3）经醛基化后的Fe3O4-葡聚糖磁性纳米颗粒可以很好的与抗βHCG抗体相偶联,且偶联物保留原抗体的活性;（4）当与强氧化剂NaIO4反应后,Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物具备了与DNA结合的能力,且磁性纳米复合物可有效保护DNA不受核酸酶的降解;（5）该纳米颗粒可成功的将DNA导入细胞内,而且它所介导的基因转移效率要明显高于脂质体（P＜0.05）;（6）该纳米颗粒具备靶向绒癌细胞和绒癌转移瘤的特性。结论:Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物可作为一种安全、有效、且具有绒癌靶向性的基因载体。第三章Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体纳米载体介导的乙酰肝素酶反义寡核苷酸对绒癌抑制作用的研究目的:通过观察经Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米颗粒介导的Hpa AS-ODN处理后,JEG-3细胞Hpa mRNA和蛋白质表达水平以及细胞侵袭能力的变化,绒癌裸鼠转移瘤体积的变化,揭示Hpa AS-ODN对的绒癌的治疗作用。方法:（1）应用MTT和Matrigel体外侵袭试验检测转染Hpa AS-ODN前后JEG-3细胞增殖能力和侵袭能力的变化;（2）应用RT-PCR和Western-blot技术检测转染前后细胞Hpa mRNA和蛋白质表达情况的变化;（3）观察转染Hpa AS-ODN后,绒癌裸鼠转移瘤体积的变化。结果:（1）转染前后JEG-3细胞增殖能力无明显变化（P＞0.05）,但转染后JEG-3细胞的侵袭能力显著降低(P＜0.05=;（2）转染HpaAS-ODN后,JEG-3细胞Hpa。mRNA和蛋白质的表达水平显著受到抑制(P＜0.05=;（3）Hpa AS-ODN可显著抑制绒癌转移瘤的生长(P＜0.05=;（4）Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米载体介导的Hpa AS-ODN体内治疗对裸鼠不产生毒副作用。结论:Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米载体介导的HpaAS-ODN通过抑制Hpa的表达,削弱了绒癌细胞的侵袭能力,而且对绒癌转移瘤具有一定的抑瘤效果。另外,Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米载体介导的Hpa AS-ODN体内治疗安全性较好。

全文目录


一、中文摘要  4-7
二、英文摘要  7-16
三、英文缩略语说明  16-19
四、论文正文  19-134
  引言  19-30
    一.乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)与绒癌  19-20
    二.Fe_3O_4-葡聚糖-抗β HCG抗体磁性纳米复合物与绒癌  20-23
    三.Fe_3O_4-葡聚糖-抗β HCG抗体磁性纳米载体介导的Hpa AS-ODN对绒癌的治疗作用  23-24
    参考文献  24-30
  第一章 乙酰肝素酶与绒毛膜癌侵袭转移关系的实验研究  30-64
    1.1 前言  30-31
    1.2 实验材料  31-36
      1.2.1 实验对象  31-32
      1.2.2 主要仪器及设备  32-33
      1.2.3 主要试剂及原料  33-36
    1.3 实验方法  36-49
      1.3.1 细胞培养  36-37
      1.3.2 噻唑盐比色实验(即MTT法)检测绒癌JEG-3细胞和JAR细胞之间增殖能力的差异  37
      1.3.3 Matrigel体外侵袭试验(Matrigel Invasion Assay)检测绒癌JEG-3细胞和JAR细胞之间侵袭能力的差异  37-40
      1.3.4 RT-PCR方法检测绒癌-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织之间Hpa mRNJEGA表达的差异  40-43
      1.3.5 western-blot方法检测绒癌JEG-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织之间Hpa蛋白表达的差异  43-47
      1.3.6 免疫化学方法检测Hpa蛋白在绒癌JEG-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织内的定位情况  47-49
    1.4 统计学处理  49
    1.5 结果  49-55
      1.5.1 MTT法检测绒癌JEG-3细胞和JAR细胞增殖能力的差异  49-50
      1.5.2 Matrigel体外侵袭试验检测绒癌JEG-3细胞和JAR细胞之间侵袭能力的差异  50-51
      1.5.3 RT-PCR方法检测绒癌JEG-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织之间Hpa mRNA表达的差异  51-52
      1.5.4 Western-blot检测绒癌JEG-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织之间Hpa蛋白表达的差异  52-53
      1.5.5 免疫化学技术检测Hpa在绒癌JEG-3细胞、JAR细胞和正常早孕绒毛组织内的定位情况  53-54
      1.5.6 Hpa mRNA和蛋白表达与绒癌细胞侵袭力相关性分析  54-55
    1.6 讨论  55-59
      1.6.1 Hpa结构和功能  55
      1.6.2 滋养层细胞的侵袭  55-57
      1.6.3 绒癌细胞侵袭力的鉴定  57-58
      1.6.4 Hpa的表达与绒癌侵袭力之间的关系  58-59
    1.7 小结  59
    参考文献  59-64
  第二章 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的制备及其相关性质的研究  64-100
    2.1 前言  64-66
    2.2 实验材料  66-69
      2.2.1 细胞株  66
      2.2.2 动物  66
      2.2.3 主要仪器及设备  66-67
      2.2.4 主要试剂及原料  67-69
      2.2.5 寡核苷酸序列  69
    2.3 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的制备及其特性的测定  69-70
      2.3.1 Fe3O4-葡聚糖磁性纳米颗粒的制备及其醛基化  69
      2.3.2 Fe3O4-葡聚糖磁性纳米颗粒与鼠抗人βHCG单克隆抗体的生物偶联  69
      2.3.3 透射电镜观察Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的形态  69-70
      2.3.4 激光粒度检测仪测定粒径  70
      2.3.5 原子吸收光谱分析仪检测Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物中铁的含量  70
    2.4 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的体外实验  70-77
      2.4.1 细胞培养  70-71
      2.4.2 噻唑盐比色实验(即MTT法)检测Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的细胞毒性  71
      2.4.3 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物免疫特性鉴定  71-74
      2.4.4 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物与基因的结合分析  74-75
      2.4.5 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的DNase I消化实验  75
      2.4.6 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物介导的基因转染效率的鉴定  75-77
      2.4.7 不同细胞对Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体-Hpa AS-ODN复合物摄入情况的鉴定  77
    2.5 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的体内实验  77-78
      2.5.1 绒毛膜癌裸鼠移植瘤的建立  77
      2.5.2 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物在裸鼠体内分布的研究  77-78
    2.6 统计学处理  78-79
    2.7 结果  79-88
      2.7.1 Fe_3O_4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物粒径及形态  79-80
      2.7.2 Fe_3O_4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物中铁的含量  80
      2.7.3 Fe_3O_4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的细胞毒性  80-81
      2.7.4 Fe_3O_4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的免疫特性  81-83
      2.7.5 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物与基因的结合分析  83-84
      2.7.6 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的基因保护实验  84-85
      2.7.7 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物介导的基因转染效率  85-86
      2.7.8 不同细胞对Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体-Hpa AS-ODN复合物的摄入情况  86-87
      2.7.9 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物在裸鼠体内的分布  87-88
    2.8 讨论  88-94
      2.8.1 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的制备原理及其物理特性  89-91
      2.8.2 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的生物相容性  91
      2.8.3 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的免疫特性  91-92
      2.8.4 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物介导的基因转染  92-93
      2.8.5 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体磁性纳米复合物的靶向性  93-94
    2.9 小结  94-95
    参考文献  95-100
  第三章 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体介导的乙酰肝素酶反义寡核苷酸对绒癌抑制作用的研究  100-134
    3.1 前言  100-102
    3.2 实验材料  102-107
      3.2.1 细胞株  102
      3.2.2 动物  102
      3.2.3 主要仪器及设备  102-103
      3.2.4 主要试剂及原料  103-107
    3.3 实验方法  107-119
      3.3.1 细胞培养  107-108
      3.3.2 Fe3O4-葡聚糖-抗βHCG抗体-Hpa AS-ODN或NS-ODN复合物的制备及细胞转染  108
      3.3.3 噻唑盐比色实验(即MTT法)检测绒癌JEG-3细胞转染前后增殖能力的变化  108-109
      3.3.4 Matrigel体外侵袭试验(Matrigel Invasion Assay)检测绒癌JEG-3细胞转染前后侵袭能力的变化  109-111
      3.3.5 RT-PCR方法检测绒癌JEG-3细胞转染前后Hpa mRNA表达的变化  111-115
      3.3.6 western-blot方法检测绒癌JEG-3细胞转染前后Hpa蛋白表达的变化  115-118
      3.3.7 Hpa AS-ODN对绒癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用  118-119
    3.4 统计学处理  119
    3.5 结果  119-126
      3.5.1 MTT法检测绒癌JEG-3细胞转染前后增殖能力的变化  119-120
      3.5.2 Matrigel体外侵袭试验检测绒癌JEG-3细胞转染前后侵袭能力的变化  120-122
      3.5.3 RT-PCR方法检测绒癌JEG-3细胞转染前后Hpa mRNA表达的变化  122-123
      3.5.4 Western-blot检测绒癌JEG-3细胞转染前后Hpa蛋白表达的变化  123-125
      3.5.5 Hpa AS-ODN对绒癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响  125-126
    3.6 讨论  126-129
    3.7 小论  129
    参考文献  129-134
五、综述  134-153
六、致谢  153-154
七、攻读学位期间已发表论文及参加的课题  154-156

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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