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周期联合甲氨蝶呤和环磷酰胺对大鼠胶原诱导性关节炎治疗作用及其机制的研究

作　者: 王彩虹
导　师: 李小峰；张奉春
学　校: 山西医科大学
专　业: 内科风湿病学
关键词: 类风湿关节炎胶原诱导关节炎细胞周期甲氨蝶呤环磷酰胺联合治疗
分类号: R593.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 3次
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内容摘要

【背景】类风湿关节炎（RA）是高度致残性疾病,药物联合治疗仍是主要方法,而目前国际上常用的联合方案尚未达到令人满意的疗效,探索新的有效联合方案具有重要的现实意义。我们借鉴联合化疗治疗白血病的成功经验,根据细胞动力学原理,在国内外首次联合细胞周期特异性药物（MTX）与周期非特异性药物（CTX）小剂量按周期间歇给药治疗RA,经过10年的临床实践,取得了显著疗效,临床缓解率高,明显降低了副作用。为了从临床实践上升到理论认识的高度,本课题开展了RA动物模型的实验研究,以阐明其联合用药机制。经联机检索国内外尚未见有类似报道,为RA的治疗提供新思路和方法。【目的】通过对RA动物模型大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的实验研究,从炎性细胞因子、滑膜细胞凋亡与细胞周期蛋白角度,研究周期联合免疫抑制剂甲氨蝶呤（MTX）和环磷酰胺（CTX）的协同效应和作用机制。【方法】建立Ⅱ型胶原诱导的雌性Wistar大鼠CIA模型,随机分为正常对照组、CIA模型对照组、小剂量MTX治疗组(0.9mg.kg^-1.w^-1)、大剂量MTX治疗组(2.7 mg.kg^-1.w^-1)、小剂量CTX间歇治疗组(24mg.kg^-1.3w^-1)、联合治疗组(MTX:0.9mg.kg^-1.w^-1+CTX:24mg.kg^-1.3w^-1)。进行24周体内实验,初次免疫后3周开始给药。治疗过程中连续对大鼠的关节炎症程度进行评分,容积法（排水法）测量双后肢的足肿胀度。治疗21周后全部动物处死取材,再经固定、脱钙、包埋,制成切片。然后各组大鼠行HE染色观察踝关节滑膜的组织病理学改变,进一步通过:a.酶联免疫吸附方法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-1的水平;b.TUNEL法检测滑膜细胞凋亡,免疫组织化学法检测突变型p53;c.滑膜细胞周期蛋白cyclin D1通过免疫组织化学法检测,原位杂交法检测eyelin D1mRNA水平。【结果】1.CIA大鼠造模成功率达83.3%（75/90）。症状、影像学、病理评估证实造模成功,为慢性关节炎,可维持24周。2.关节炎指数（AI）:各治疗组AI均较模型组明显改善,联合治疗组优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.0 5）,与大剂量MTX组相近（P＞0.0 5）;联合治疗组足肿胀度改善程度最明显（P＜0.05）。3.HE关节病理改变:CIA模型组大鼠的滑膜层次增多,可达6-8层,甚至10余层,排列紊乱,大量炎性细胞浸润,软骨、骨组织严重侵蚀;小剂量MTX、CTX治疗组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀有所减轻;联合治疗组和大剂量MTX治疗组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀明显改善。4.血清TNF-α、IL-1水平在CIA模型组增高（P＜0.05）,CIA模型组6周和24周TNF-α水平均比正常对照组增高,CIA模型组24周TNF-α水平高于6周（P＜0.05）。联合治疗组抑制TNF-α与IL-1优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.05）,与大剂量MTX组接近（P＞0.05）。5.滑膜细胞凋亡:（1）各治疗组滑膜细胞凋亡均较CIA模型组增加,联合治疗组凋亡程度最高,各组间平均灰度值差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）突变型p53在CIA组表达上调（P＜0.05）,联合治疗组下调突变型p53优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.05）,与大剂量MTX组相当（P＞0.05）。（3）经析因设计方差分析,滑膜细胞凋亡和突变型p53平均灰度值显示MTX与CTX有交互作用（P＜0.05）,联合治疗组优于单用药小剂量治疗组（P＜0.05）,提示MTX和CTX联合治疗为协同效应。6.滑膜细胞周期蛋白:免疫组化法检测各组滑膜组织cyclin D1呈阴性表达。原位杂交检测CIA模型组大鼠关节滑膜组织的cyclin D1 mRNA的阳性染色强度明显高于正常对照组（P＜0.05）,各治疗组滑膜cyclin D1 mRNA下调,联合治疗组cyclin D1mRNA表达最低,各组间平均灰度值差异有统计学意义（P＜0.05）。MTX与CTX有交互作用（P＜0.05）,联合治疗组优于单用药治疗组,提示MTX和CTX联合治疗为协同效应。【结论】1.在CIA大鼠模型中:血清TNF-α、IL-1水平异常增高;突变型p53表达上调;滑膜cyclin D1mRNA表达上调,导致滑膜异常增殖。2.联合治疗组在改善关节炎症状、改善滑膜病理改变,抑制血清TNF-α、IL-1水平,诱导滑膜细胞凋亡及下调突变型p53表达,下调滑膜cyclin D1 mRNA表达,均优于小剂量MTX、CTX治疗组。3.MTX和CTX存在药物交互作用,提示MTX和CTX周期联合治疗为协同效应。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-21
实验总体设计  21-22
第一部分胶原诱导关节炎动物模型的建立  22-33
  材料与方法  22-25
  实验结果  25-29
  结论  29
  讨论  29-33
第二部分 MTX和CTX联合治疗CIA的协同效率及作用机制  33-75
  材料与方法  33-43
  实验结果  43-60
  讨论  60-75
结论  75-76
本文创新点  76-77
参考文献  77-85
综述  85-111
  类风湿关节炎发病机制的研究进展——炎性细胞因子对滑膜细胞凋亡及细胞周期蛋白影响的研究进展  85-111
个人简介  111-112
致谢  112

周期联合甲氨蝶呤和环磷酰胺对大鼠胶原诱导性关节炎治疗作用及其机制的研究

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