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ROCKⅡ对人早孕期细胞滋养细胞侵润能力的调节作用及其机制的研究

作　者: 李秋玲
导　师: 尚涛
学　校: 中国医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: RhoA ROCK II ERM Y-27632 胎盘 细胞滋养细胞 胚胎着床 侵润
分类号: R714.24
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


前言胚泡着床是指胚泡逐渐埋入子宫内膜的过程,是一个复杂和精细的过程,可分为定位、粘附、突破、侵入等阶段。着床开始于胚胎与子宫内膜粘膜层的黏附,即囊胚的滋养层细胞与子宫上皮的游离面相接触后紧密粘附,然后,具有高度侵蚀能力的细胞滋养细胞突破外层的合体滋养细胞,形成多层细胞柱（滋养细胞柱）向母体方向侵蚀,与宫壁接触,形成滋养细胞壳覆盖蜕膜面,并侵蚀入子宫蜕膜及子宫螺旋动脉至子宫肌层1/3段,破坏血管中层肌弹力纤维。此过程称为生理性血管重铸。生理性血管重铸的完成一方面使螺旋动脉管壁变薄,另一方面使肾上腺素能神经丧失对血管的支配,使其进行性扩张。从而建立低阻力动脉系统,保证了胎儿生长对血流增加的需要。胎盘绒毛膜外细胞滋养细胞侵袭能力适中是生理妊娠建立、维持和适时终止的关键。胎盘绒毛膜外细胞滋养细胞侵袭能力过强可发生胎盘植入和滋养细胞肿瘤,过弱则可导致流产、早产、胎儿发育迟缓（FGR）、胎死宫内、妊娠期高血压疾病等病理妊娠。RhoGTP酶,是目前研究最为清楚的Ras相关单体GTP酶,为小三磷酸鸟苷（GTP）酶家族的一员。它的最重要的效应因子是Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶,简称ROK或ROCK。ERM蛋白是已知的ROCK的底物,包括ezrin、radixin与moesin,是将细胞骨架与细胞膜连接起来的细胞骨架蛋白。Rho/ROCK/ERM通路在细胞的形态、运动、侵袭、粘附、极性形成、有丝分裂等过程中发挥重要作用,从而参与多种疾病的发病过程,例如恶性肿瘤、伤口的愈合等。而人类的胚泡植入,即细胞滋养细胞侵润子宫内膜层及浅肌层的“着床”过程,与恶性肿瘤的侵袭过程非常相似。Rho/ROCK/ERM通路是否在人早孕期胚泡植入中发挥作用,目前国内外尚无报导。本论文研究的就是这方面的问题。目的本研究通过检测RhoA、ROCKⅡ、ERM在人早孕期绒毛组织和体外培养细胞滋养细胞中的表达与定位,ROCKⅡ活性被Y-2763抑制时细胞滋养细胞生长、运动、侵袭能力的改变及磷酸化ERM蛋白表达的变化,来了解ROCKⅡ在细胞滋养细胞中对ERM蛋白的调控,探索RhoA、ROCKⅡ、ERM与细胞滋养细胞侵润的关系,间接判断Rho/ROCK/ERM通路是否在人早孕期胚泡植入中发挥作用,为自然流产、妊娠期高血压疾病等由于孕早期胚泡植入异常引起的胎盘疾病的病因研究及临床药物治疗提供理论依据。方法本文通过免疫组化和western blot检测RhoA、ROCKⅡ、ERM在人早孕期绒毛组织中的表达和定位,通过免疫荧光细胞化学法来检测RhoA、ROCKⅡ、ERM在体外培养细胞滋养细胞中的表达与定位,通过噻唑蓝实验、体外细胞侵袭实验和细胞运动实验来检测不同浓度的ROCK抑制剂Y-27632处理后细胞滋养细胞生长、运动、侵袭能力的改变,通过Rho激酶活性测定和western blot来检测不同浓度的ROCK抑制剂Y-27632处理对细胞滋养细胞中ROCKⅡ活性和磷酸化ERM蛋白表达的影响。结果1.通过免疫组化和western blot方法检测到,在人早孕期绒毛组织中,RhoA在细胞滋养细胞的胞浆中表达,ROCKⅡ在细胞滋养细胞和合体滋养细胞的胞浆中均有表达,ERM在细胞滋养细胞近胞膜处的胞浆中表达;通过免疫荧光化学法检测到RhoA、ROCKⅡ和ERM均在细胞滋养细胞中的胞浆中表达,ERM在胞浆中的近细胞膜处表达;2.噻唑蓝实验结果显示,经不同浓度的Y-27632处理后细胞滋养细胞A492nm吸光度值均有不同程度的下降,细胞生长受到抑制。当Y-27632浓度为50μmol/L以上时明显抑制细胞的生长,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。且随着药物质量浓度的升高,对细胞的抑制作用越明显,具有剂量依赖趋势;体外细胞侵袭实验显示,应用ROCK特异性抑制剂Y-27632处理体外培养细胞滋养细胞,浓度分别为5、10和25μmol/L,培养2h后细胞侵润指数分别为0.87±0.08、0.75±0.09和0.58±0.03,均抑制滋养细胞侵润,且呈浓度依赖关系,当Y-27632浓度为10和25μmol/L时对细胞滋养细胞侵润的抑制作用与对照相比具有显著性差异（P＜0.05）;运动实验结果显示,随着药物浓度的升高,运动指数逐渐降低,当Y-27632浓度为5、10和25μmol/L时,对细胞滋养细胞运动能力有显著抑制作用,运动指数分别为0.83±0.07、0.68±0.03和0.54±0.06。与对照组相比,差异显著（P＜0.05）。3.应用Rho-Kinase活性测定试剂盒检测不同浓度的Y-27632处理后体外培养原代细胞滋养细胞中ROCKⅡ活性改变,结果显示随着ROCKⅡ抑制剂Y-27632浓度的增加,ROCKⅡ活性逐渐下降,呈剂量依赖性,统计学有显著差异（P＜0.05）。应用western blot检测不同浓度的Y-27632处理后细胞滋养细胞中ERM和p-ERM（ezrin Thr567,radixinThr564,moesin Thr558）的蛋白表达,结果显示随着Y-27632浓度的增加,ERM表达无明显改变,p-ERM蛋白表达逐渐下降,统计学有显著差异（P＜0.05）。结论RhoA、ROCKⅡ、ERM均在人早孕期胎盘组织和体外培养的细胞滋养细胞中表达,ROCKⅡ在体外培养的细胞滋养细胞中可能通过调节ERM蛋白来调节细胞的生长、侵袭和运动能力,提示Rho/ROCK/ERM通路可能在人孕早期胚泡植入过程中发挥作用。

全文目录


一、摘要  6-14
  中文论著摘要  6-10
  英文论著摘要  10-14
二、英文缩略语  14-16
三、论文  16-56
  论文一  16-31
    前言  16
    材料与方法  16-23
    实验结果  23-26
    讨论  26-30
    结论  30-31
  论文二  31-48
    前言  31
    材料与方法  31-40
    实验结果  40-45
    讨论  45-47
    结论  47-48
  论文三  48-56
    前言  48
    材料与方法  48-51
    实验结果  51-53
    讨论  53-55
    结论  55-56
四、本研究创新性的自我评价  56-57
五、参考文献  57-63
六、附录  63-82
  综述  63-80
    参考文献  73-80
  在学期间科研成绩  80-81
  致谢  81-82
  个人简介  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠） > 妊娠中毒症
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