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ULBPs的免疫识别机制、其剪切变体的功能以及相关的肿瘤免疫逃逸机制的研究

作　者: 曹伟
导　师: 何维；崔莲仙
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 单克隆抗体医科大学流式细胞仪完全培养基选择性剪切胞内区协和博士学位论文识别机制小牛血清
分类号: R730.3
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

NKG2D是一种C型凝集素激活性受体，由同源二聚体构成，可表达于NK、NKT、CD8⁺αβT和γδT等多种免疫细胞表面，在固有免疫和适应性免疫应答中都起着非常重要的作用。近几年来，ULBPs（又称为RAET1分子）作为一类新发现的人NKG2D配体家族日益受到关注。该基因家族业已报道的成员有ULBP1（RAET1I）、ULBP2（RAET1H）、ULBP3（RAET1N）、ULBP4（RAET1E）和ULBP5（RAET1G）。从结构上看，所有的ULBPs成员都与MHC-Ⅰ类分子相类似，即都含α1和α2功能域，但不含α3功能域和β2微球蛋白。其中前三者即ULBP1～3是通过GPI（糖基磷脂酰肌醇）连接的膜蛋白亚家族，而后两者RAET1E和RAET1G则是含跨膜区和胞内区的膜蛋白亚家族。此外，RAET1G通过选择性的剪切还能生成不含跨膜区和胞内区的截短变体RAET1G2。ULBPs可表达于多种肿瘤细胞的表面，不仅是NKG2D的功能性配体，而且可能还可以通过TCRγδ1途径直接激活γδT细胞，并在抗肿瘤的免疫反应中发挥重要的作用。本文的第一项研究内容旨在利用先期MICA和γδT细胞研究的工作基础，就ULBPs激活γδT细胞的抗肿瘤作用及其免疫识别机制开展研究。通过人类ULBPs基因克隆与重组蛋白的表达、ULBPs单克隆抗体制备等基础性工作，建立ULBPs体外扩增γδT细胞的方法，并观察其对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用；同时开展对ULBPs反应性γδT细胞的CDR3区序列分析、TCR和NKG2D在γδT细胞免疫识别和活化中的关系分析等研究，为ULBPs类新分子的抗肿瘤作用和其免疫识别机制研究以及γδT细胞过继免疫治疗肿瘤的新策略奠定理论和实验基础。ULBPs和MICA反应性γδT细胞过继免疫治疗肿瘤的方法可克服目前普遍应用的αβT细胞特异性抗肿瘤免疫治疗中出现的肿瘤抗性和抗原呈递低下等主要缺陷，因此该新策略在肿瘤过继免疫治疗方面有着光明的应用前景。首先，从人红白血病细胞系K562、人宫颈癌细胞系Hela、人浆液性卵巢腺癌细胞系HO-8910中提取总RNA，通过RT-PCR技术分别克隆了ULBP1、RAET1G和RAET1G2；ULBP2和ULBP3；ULBP4的全长cDNA。利用pET原核表达系统重组表达了ULBPs家族的所有成员；此外，还利用pcDNA^TM3.1/myc-His（-）A真核表达载体系统在CHO中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达全长的ULBPs基因家族，同时还分泌表达了ULBP3的胞外功能域，这些系统的建立为后续研究奠定了基础。其次，分别利用原核表达的重组ULBP4和RAET1G2蛋白制备了特异性单克隆抗体。通过ELISA、间接免疫荧光、流式细胞仪和Western blot等技术对单克隆抗体进行了特异性鉴定。这些抗体的获得为进一步的研究提供了有力的工具。最后，对ULBPs家族中的ULBP3成员进行了初步的研究。在实验的早期阶段，由于未能获得肿瘤患者的外周血或肿瘤组织，我们对健康人的外周血进行了尝试，结果发现：ULBP3在体外不仅能刺激健康人外周血NK细胞的增殖（54.7％VS 9.9％），还能刺激γδT细胞的增殖（15.3％VS 2.7％），考虑到扩增γδT细胞的效率较低，直接做功能研究需要大量的PBMC并进行流式分选，因而我们采用折中的研究策略——即直接对其CDR3区序列进行分析，结果显示：δ1亚型中某一序列呈优势分布，占到了78.57％（33/42），而在抗TCRγδ特异性抗体扩增来源的δ1序列库中，该优势序列只占到了10.71％（3/28），这一差别具有明显的统计学意义（P＜0.05％）。氨基酸序列分析显示：与小鼠中T22特异性的TCRδ序列相类似的，ULBP3-δ1主型序列具有完整的Vδ1、D3和Jδ1胚系基因片断。但有趣的是：γ9的CDR3区序列并没有明显的优势分布特征，提示TCRγδ1对ULBP3的识别可能以δ1链为主，而不依赖于γ链。为了进一步证明该TCRγδ1对ULBP3识别的特异性，我们从ATCC引进了用于证明抗原特异性TCR的J.RT3-T3.5细胞。遗憾的是，接下来的TCRγδ1全长基因转染研究因载体的原因导致TCR表达量很低而未能成功，但是这部分研究内容为今后抗原特异性TCR基因转染平台的成功建立以及γδT细胞对ULBPs家族其他成员的识别研究工作积累了经验。本文的第二项研究内容旨在鉴定我们所发现的ULBPs剪切变体的功能——即是否都是人NKG2D的功能性配体?最初，我们在克隆ULBPs基因家族的过程中意外地发现ULBP4的三个剪切变体（ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-Ⅲ）和RAET1G2的一个剪切变体（RAET1G3），尽管这些变体的发生频率比较低（＜5％）。氨基酸序列分析显示：这些变体与其各自的父本序列比较有小片段氨基酸的缺失或插入。功能研究显示：转染了ULBP4各剪切变体的Raji细胞和CHO细胞都能被NKG2D-hIgG1Fc段融合蛋白所识别；此外，和游离性的RAET1G2一样，ULBP4各剪切变体的胞外段功能域蛋白以及RAET1G3与NK-92细胞共育后都能下调后者NKG2D的表达，从另一方面也证明了它们都是人NKG2D的功能性配体；最后，原核表达的RAET1G3重组蛋白还能刺激NK-92细胞分泌IFN-γ。综合以上的实验结果，证明所发现的这些ULBPs剪切变体都是人NKG2D的功能性配体，这一结果提示人NKG2D受体对其配体的识别具有很强的可塑性；同时，这一发现将有助于我们更加全面地了解ULBPs基因家族。本文的第三项研究内容旨在分析ULBPs中含跨膜区和胞内区的膜蛋白亚家族成员RAET1E（即ULBP4）是否参与了肿瘤逃逸以及其逃逸机制如何?首先，我们在克隆RAET1E基因的过程中克隆到了其截短的不含跨膜区和胞内区的基因（我们命名为RAET1E2），并且在蛋白质水平证明了该截短基因的存在。其次，功能研究显示：RAET1E2阳性的肿瘤细胞培养上清、RAET1E2基因转染的COS-7细胞培养上清以及RAET1E2重组表达蛋白与NK-92细胞共育后都能明显下调后者NKG2D的表达，而且NK-92细胞在其NKG2D下调表达之后对多种靶细胞的细胞毒性作用明显下降。综合以上的实验结果，除了已经发现的在蛋白水平的脱落所介导的免疫逃逸机制（例如MICA和ULBP2），我们首次发现了：ULBPs在RNA水平的选择性剪切能生成截短的不含跨膜区和胞内区的可溶性的蛋白，从而介导某些肿瘤的免疫逃逸，这一发现丰富了我们对肿瘤免疫逃逸机制的认识，进而为肿瘤逃逸的免疫干预提供新的信息和更多的靶点。本文的第四项研究内容为人外周血γδT细胞体外扩增方法的建立，该技术方法的建立与改进将为以后的实验研究提供有力的工具。综上所述，本文具有以下几个创新点：1.开展TCRδ1-CDR3区的结构生物学研究，发现了ULBP3反应性的61主型序列，其CDR3区序列如下：CALGELGSYLYWGIRYTDKLIFGKG，共25个氨基酸，具有完整的Vδ1、D3和Jδ1胚系基因片断，为深入了解TCRδ1-CDR3区在免疫识别中所起的作用提供了必要的信息；2.新发现多个有功能的ULBPs剪切变体，即都能被人NKG2D激活性受体所识别，为更加全面地了解ULBPs基因家族提供了线索；3.除了已报道的三个ULBPs相关的肿瘤逃逸机制外（包括蛋白水平的脱落机制），首次发现ULBPs在RNA水平的选择性剪切能生成截短的不含跨膜区和胞内区的可溶性的蛋白（RAET1E2），从而介导某些肿瘤的免疫逃逸，丰富了我们对ULBPs所介导的肿瘤免疫逃逸机制的认识。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
缩略词表  13-15
前言  15-18
第一部分 ULBPs基因的克隆、表达、单克隆抗体制备以及ULBP3免疫识别机制的初步研究  18-75
  一、材料  18-28
  二、方法  28-46
  三、结果  46-71
  四、讨论  71-75
第二部分 ULBPs基因家族剪切变体的克隆、表达以及功能鉴定  75-98
  一、材料  75-76
  二、方法  76-82
  三、结果  82-93
  四、讨论  93-98
第三部分 ULBPs相关的肿瘤免疫逃逸机制的研究  98-117
  一、材料  98-100
  二、方法  100-105
  三、结果  105-114
  四、讨论  114-117
第四部分体外扩增人外周血的γδT细胞方法的建立  117-121
  一、材料  117
  二、方法  117-118
  三、结果  118-119
  四、讨论  119-121
小结  121-123
参考文献  123-131
文献综述  131-164
附录  164-194
致谢  194-196
个人简历  196-197

ULBPs的免疫识别机制、其剪切变体的功能以及相关的肿瘤免疫逃逸机制的研究

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