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叶酸聚乙二醇作为放射性核素和抗肿瘤药物载体用于淋巴转移肿瘤的研究

作　者: 刘敏
导　师: 陆伟跃；周光兴；姚明；钟高仁
学　校: 复旦大学
专　业: 药剂学
关键词: 淋巴肿瘤靶向 叶酸修饰 聚乙二醇 多肽序列 阿霉素
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 601次
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内容摘要


淋巴转移是肿瘤最常见的转移途径之一,但常规诊断和治疗方法对淋巴转移肿瘤的效果差。局部注射后,高分子载体可选择性导向淋巴系统。目前文献报道亲淋巴的高分子载体对淋巴转移肿瘤细胞的靶向程度低,且不能有效地调控抗肿瘤药物从高分子载体上释放。鉴于此。本文旨在通过"聚乙二醇载体"、"主动靶向头基修饰"和"酶敏感释药"策略解决上述高分子载体药物的不足,研制了可供局部给药的叶酸聚乙二醇复合物,为叶酸聚乙二醇作为放射性核素和抗肿瘤药物载体主动靶向淋巴转移肿瘤的研究提供理论和实验基础。本文的研究内容包括:叶酸─聚乙二醇高分子载体的制备及表征;叶酸-聚乙二醇—二乙三胺五醋酸作为放射性核素载体用于淋巴转移肿瘤影像诊断的研究;叶酸聚乙二醇阿霉素复合物的制备及初步药效学试验。叠氮化物还原法制备了双氨基聚乙二醇─H2N-PEG-NH2,并优化了反应条件,使氯代、叠氮化和催化氢化的产率分别达到75%、87%和88%。采用阳离子交换法纯化H2N-PEG-NH2,有效地除去了HO-PEG-NH2和HO-PEG-OH等杂质,使H2N-PEG-NH2的纯度达到95%以上。采用高效液相色谱法、红外光谱和核磁共振等方法对H2N-PEG-NH2的结构进行了检测,确定H2N-PEG-NH2的分子结构。通过二环己基碳二亚胺脱水,经酰化反应合成了Folate-PEG。建立了纯化方法,采用阴离子交换法分离除去了H2N-PEG-NH2、Folate-PEG-Folate和Folic acid等杂质,使Folate-PEG的纯度达到95%以上。高纯度的Folate-PEG的制备为后续研究奠定了良好的基础。荧光示踪法和活体荧光体内成像法考察了Folate-PEG与叶酸受体的结合活性。结果表明Folate-PEG保持了与叶酸受体的结合活性,可通过叶酸受体介导的内吞富集肿瘤细胞或靶向肿瘤组织。制备了用于淋巴转移肿瘤诊断研究的放射性核素载体─Folate-PEG-DTPA。竞争抑制125I-叶酸与肿瘤细胞结合试验测得Folio acid和Folate-PEG-DTPA的IC50值均分别为0.7726和4.37pmol/L。结果表明,Folate-PEG-DTPA能够与125I-叶酸竞争细胞膜上的叶酸受体,无叶酸修饰的MPEG-DTPA不能够竞争叶酸受体。采用乙二胺作为双功能基团连结异硫氰荧光素和Folate-PEG-DTPA,制备了Folate-PEG-DTPA的荧光标记物。荧光示踪法考察了肿瘤细胞对Folate-PEG-DTPA的定性摄取。结果表明Folate-PEG-DTPA可通过叶酸受体介导的内吞富集叶酸受体高表达的肿瘤细胞。建立了放射性核素标记Folate-PEG-DTPA的方法,优化了标记条件,使Folate-PEG-DTPA-99mTc的放化纯度达到96%。室温下,Folate-PEG-DTPA-99mTc的稳定性良好,24小时内放射化学纯度不低于95%。放射性示踪法考察了皮下给药Folate-PEG-DTPA-99mTc的淋巴系统导向性。大鼠和小鼠试验结果表明:Folate-PEG-DTPA99mTc在淋巴结的蓄积量显著高于的其它脏器和组织（肾脏除外）。多肽固相合成法制备了Folate-Cys和酶敏感寡肽序列─Gly-Phe-Leu-Gly。制备了两种叶酸聚乙二醇化合物:Folate-PEG-SAD-DOX和Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX,两者的化学纯度均达到95%以上。MTT法定量考察叶酸聚乙二醇阿霉素复合物对肿瘤细胞的杀伤作用:DOX、Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX和Folate-PEG-SAD-DOX的IC50分别为0.16、0.79和3.92μmol/L。在7.42×10-10～1.16×10-5mol/L的范围内,没有测出Mal-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX和MPEG-SAD-DOX的IC50。结果表明,采用酶敏感寡肽序列连接的叶酸聚乙二醇阿霉素复合物具有显著抗肿瘤作用。荧光示踪法验证考察了皮下给药叶酸聚乙二醇阿霉素复合物的淋巴系统导向性。结果证明:Folate-PEG-SAD-DOX和Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX在淋巴结的蓄积量均显著高于其它脏器和组织。作为排泄器官,肾脏也有较高的药物蓄积,但蓄积量低于淋巴系统。

全文目录


中文摘要  9-11
英文摘要  11-14
缩略语表  14-17
前言  17-20
  一、研究背景  17-19
  二、本论文研究目的和研究内容  19-20
第一部分 叶酸─聚乙二醇高分子载体的制备及表征  20-38
  Ⅰ.Folate-PEG的制备及结构表征  21-30
    一、H_2N-PEG-NH_2的制备及结构表征  21-26
      1、材料与仪器  21
      2、方法  21-23
        2.1 H_2N-PEG-NH_2的制备  21-22
        2.2 H_2N-PEG-NH_2的分离纯化  22-23
        2.3 H_2N-PEG-NH_2的结构表征  23
      3、结果  23-25
      4、讨论  25-26
    二、Folate-PEG的制备及结构表征  26-30
      1、材料与仪器  26
      2、方法  26-27
        2.1 Folate-PEG的制备  26-27
        2.2 Folate-PEG的分离纯化  27
        2.3 Folate-PEG的纯度检测  27
        2.4 Folate-PEG的结构表征  27
      3、结果与讨论  27-30
  Ⅱ.Folate-PEG的受体结合活性测定  30-37
    一、Folate-PEG-FITC的制备及检测  30-31
      1、材料与仪器  30
      2、方法  30
        2.1 Folate-PEG-FITC的制备与纯化  30
        2.2 Folate-PEG-FITC的纯度检测  30
      3、结果与讨论  30-31
    二、细胞学水平考察Folate-PEG的受体结合活性  31-34
      1、材料与仪器  31-32
      2、方法  32
      3、结果与讨论  32-34
    三、模型动物水平考察Folate-PEG的受体结合活性  34-37
      1、材料与仪器  34
      2、方法  34
      3、结果与讨论  34-37
  小结  37-38
第二部分 叶酸─聚乙二醇—二乙三胺五醋酸作为放射性性核素载体用于淋巴转移肿瘤影像诊断的研究  38-57
  Ⅰ.Folate-PEG-DTPA及其荧光标记和放射性标记物的制备及表征  39-49
    一、Folate-PEG-DTPA的制备及表征  39-42
      1、材料与仪器  39
      2、方法  39-40
        2.1 Folate-PEG-DTPA的制备  39-40
        2.2 Folate-PEG-DTPA的纯化  40
        2.3 Folate-PEG-DTPA的纯度检测  40
        2.4 Folate-PEG-DTPA的结构测定  40
      3、结果  40-42
      4、讨论  42
    二、Folate-PEG-DTPA-~(99m)Tc的制备及质量控制  42-44
      1、材料与仪器  42
      2、方法  42-43
        2.1 Folate-PEG-DTPA的放射性标记  43
        2.2 标记产物的鉴定  43
      3、结果  43-44
        3.1 放射化学纯度  43-44
        3.2 标记产物的稳定性  44
      4、讨论  44
    三、EDA-FITC的制备与纯化  44-46
      1、材料与仪器  44
      2、方法  44-45
        2.1 EDA-FITC的制备与纯化  44-45
        2.2 EDA-FITC的纯度检测  45
        2.3 EDA-FITC的定性鉴别  45
      3、结果与讨论  45-46
    四、Folate-PEG-DTPA-FITC的制备及检测  46-49
      1、材料与仪器  46-47
      2、方法  47
        2.1 Folate-PEG-DTPA-FITC的制备与纯化  47
        2.2 Folate-PEG-DTPA-FITC的纯度检测  47
      3、结果与讨论  47-49
  Ⅱ.细胞学水平考察Folate-PEG-DTPA的肿瘤靶向性  49-53
    1、材料与仪器  49
    2、方法  49
      2.1 Folate-PEG-DTPA竞争抑制~(125)I-叶酸与肿瘤细胞结合试验  49
      2.2 荧光示踪法考察肿瘤细胞对Folate-PEG-DTPA的定性摄取  49
    3、结果  49-52
      3.1 叶酸-聚乙二醇复合物对肿瘤细胞的特异性亲和作用  49-50
      3.2 Folate-PEG-DTPA对肿瘤细胞的靶向性  50-52
    4、讨论  52-53
  Ⅲ.动物水平考察Folate-PEG-DTPA-~(99m)Tc的淋巴系统导向性  53-56
    1、材料与仪器  53
    2、方法  53
      2.1 Folate-PEG-DTPA-~(99m)Tc正常大鼠分布实验  53
      2.2 Folate-PEG-DTPA-~(99m)Tc小鼠分布实验  53
    3、结果  53-56
    4、讨论  56
  小结  56-57
第三部分 叶酸聚乙二醇阿霉素复合物的制备及初步药效学试验  57-92
  Ⅰ.叶酸─聚乙二醇─琥珀酸─阿霉素的制备  59-67
    一、Folate-PEG-SAD的制备  59-62
      1、材料与仪器  60
      2、方法  60-61
        2.1 Folate-PEG-SAD的制备  60
        2.2 Folate-PEG-SAD的纯度检测  60
        2.3 Folate-PEG-SAD的结构检测  60-61
      3、结果  61-62
      4、讨论  62
    二、Folate-PEG-SAD-DOX的制备  62-67
      1、材料与仪器  62-63
      2、方法  63
        2.1 Folate-PEG-SAD-DOX的制备  63
        2.2 Folate-PEG-SAD-DOX的纯化  63
        2.3 Folate-PEG-SAD-DOX的纯度检测  63
        2.4 Folate-PEG-SAD-DOX的结构检测  63
      3、结果  63-65
      4、讨论  65-67
  Ⅱ.叶酸─聚乙二醇─甘氨酸苯丙氨酸亮氨酸甘氨酸─阿霉素的制备  67-84
    一、Folate-Cys的制备  69-73
      1、材料与仪器  69-70
      2、方法  70-71
        2.1 Folate-Cys的制备  70
        2.2 Folate-Cys的纯化  70
        2.3 Folate-Cys的纯度检测  70-71
        2.4 Folate-Cys的定性鉴别  71
      3、结果  71-73
      4、讨论  73
    二、Gly-Phe-Leu-Gly的制备  73-76
      1、材料与仪器  73
      2、方法  73-75
        2.1 Gly-Phe-Leu-Gly的制备  73-74
        2.2 Gly-Phe-Leu-Gly的纯化  74
        2.3 Gly-Phe-Leu-Gly的纯度检测  74-75
        2.4 Gly-Phe-Leu-Gly的定性鉴别  75
      3、结果  75-76
    三、MAL-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的制备  76-79
      1、材料与仪器  76
      2、方法  76-77
        2.1 MAL-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的制备和纯化  76-77
        2.2 MAL-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的纯度检测  77
        2.3 MAL-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的结构测定  77
      3、结果  77-78
      4、讨论  78-79
    四、Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的制备  79-81
      1、材料与仪器  79
      2、方法  79-80
        2.1 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的制备和纯化  79-80
        2.2 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的纯度检测  80
        2.3 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly的结构测定  80
      3、结果  80-81
      4、讨论  81
    五、Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX的制备  81-84
      1、材料与仪器  81
      2、方法  81-82
        2.1 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX的制备和纯化  81-82
        2.2 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX的纯度检测  82
        2.3 Folate-PEG-Gly-Phe-Leu-Gly-DOX的结构测定  82
      3、结果  82-84
  Ⅲ.细胞水平考察叶酸聚乙二醇阿霉素复合物抗肿瘤作用  84-92
    一、定性考察叶酸聚乙二醇阿霉素复合物抗肿瘤作用  84-87
      1、材料与仪器  84
      2、方法  84
      3、结果与讨论  84-87
    二、定量考察叶酸聚乙二醇阿霉素复合物抗肿瘤作用  87-90
      1、材料与仪器  87
      2、方法  87-88
      3、结果  88-89
      4、讨论  89-90
    Ⅳ.考察叶酸聚乙二醇复合物淋巴系统导向性  90-92
      1、材料与仪器  90
      2、方法  90-91
        2.1 方法回收率测定  90
        2.2 叶酸聚乙二醇复合物正常大鼠分布实验  90-91
      3、结果  91-92
      4、讨论  92
小结  92-94
结语  94-95
附图  95-107
参考文献  107-119
攻读博士间发表的论文、专利和获奖情况  119-122
致谢  122-123

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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