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无花瓣油菜Apet33-10花器官形态发生及差异表达基因分析

作　者: 周云涛
导　师: 赵云
学　校: 四川大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘蓝型油菜 无花瓣 花器官 消减抑制杂交 实时定量PCR 酵母双杂交 转基因
分类号: S565.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 200次
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内容摘要


Apet33-10(Brassica napus)是一个单基因控制的无花瓣甘蓝型油菜突变体。形态学观察结果显示，在花器官原基形态发生、分化阶段，无花瓣油菜和有花瓣油菜之间没有形态学的差异；而当花器官原基进入生长、增殖及特化阶段，无花瓣油菜的花器官始终没有观察到花瓣的生长和分化。无花瓣油菜Apet33-10的花瓣发育障碍发生在花器官形态发生和分化的早期阶段。以Apet33-10和有花瓣油菜Pet33-10早期花蕾为材料，通过抑制消减杂交和RT-PCR方法，分离和鉴定了18个差异表达基因。这些基因的功能涉及多个方面，如花瓣的特征决定、钙离子信号转导、前体mRNA的剪接和加工、蛋白质的合成与降解、细胞骨架的构建、H~+的转运、核酸的结合、生物碱的合成等。除了APETALA3基因特异性参与花瓣发育调控外，其余的基因都是植物细胞生长、发育所必需的。Apet33-10的无花瓣突变可能导致了主要的转录因子(如AP3)的表达变化，从而引起级联效应，使得一系列植物生长、发育的相关基因在转录水平上的发生改变，最终导致花瓣的缺失。通过RT-PCR克隆得到了在Apet33-10中下调表达的三个AP3基因(BnAP3-2、BnAP3-3和BnAP3-4)。进化树分析显示这三个AP3基因分属3个不同的进化簇，BnAP3-2与甘蓝(B.oleracea)的Boi2AP3在同一簇：BnAP3-3与甘蓝的BoilAP3在同一簇，而BnAP3-4与白菜型油菜(B.rapa)的BrAP3在同一簇。Real-time定量PCR分析结果显示，在野生型甘蓝型油菜早期花蕾中的表达比例为3．67：3．68：1：在无花瓣油菜中3个基因表达量均被下调，依次为野生型的36．6％、28．3％和66．8％，AP3的整体表达量相当于野生型油菜的45％，3个基因的表达比例为2．19：1．74：1。在无花瓣油菜雄蕊中，AP3基因的表达量正常。酵母双杂交结果显示三个AP3与BnPI-3具有不同强度的相互作用能力，序列差异、不同的表达模式以及与PI结合强弱的差异，显示出甘蓝型油菜中3个AP3存在一定的功能分化。小核糖核蛋白D1(BnSmD1)在Apet33-10幼嫩花蕾中表达量显著降低。为了研究其功能，构建了BnSmD1正义植物表达载体pFGC-BnSmD1(+)和反义植物表达载体pFGC-BnSmD1(-)。以甘蓝型油菜197子叶柄为外植体，经5．0mg/L的Basta选择，总共获得52株再生苗，其中包括正义BnSmD1表达载体转化的再生苗43株和反义BnSmD1表达载体转化的再生苗9株。部分BnSmD1正义表达的转基因植株得到PCR验证，为进一步研究油菜小核糖核蛋白的功能奠定了基础。

全文目录


中文摘要  12-14
Abstract  14-17
第一章 无花瓣油菜Apet33-10花器官形态观察  17-29
  1 引言  18-19
  2 材料与方法  19-20
    2.1 材料与试剂  19-20
      2.1.1 植物材料  19
      2.1.2 试剂  19-20
    2.2 实验方法和步骤  20
      2.2.1 常规石蜡切片  20
      2.2.2 形态学观察  20
  3 实验结果  20-24
    3.1 花器官原基分化  20-21
    3.2 花器官原基增殖和特化  21-23
    3.3 花器官成熟阶段  23-24
  4 讨论  24-25
  5 小结  25-26
  参考文献  26-29
第二章 无花瓣油菜Apet33-10差异表达基因分析  29-68
  1 引言  30-31
  2 材料与方法  31-44
    2.1 材料  31-33
      2.1.1 植物材料  31
      2.1.2 引物与接头  31-32
      2.1.3 菌株和载体  32-33
      2.1.4 试剂和工具酶  33
    2.2 实验方法和步骤  33-44
      2.2.1 总RNA的分离和mRNA纯化  33-34
      2.2.2 抑制性削减杂交  34-40
        2.2.2.1 Tester和Driver的双链cDNA合成及其纯化  36
        2.2.2.2 RsaI酶切双链cDNA  36
        2.2.2.3 酶切后的Tester cDNA与接头的连接  36-37
        2.2.2.4 二次消减杂交  37-38
        2.2.2.5 二轮PCR扩增  38-39
        2.2.2.6 消减效率的分析  39-40
      2.2.3 消减文库的构建  40-41
        2.2.3.1 JM109感受态细胞的制备  40
        2.2.3.2 PCR产物的纯化和连接、转化  40-41
      2.2.4 斑点杂交  41-42
      2.2.5 序列测定和分析  42
      2.2.6 半定量RT-PCR  42-44
        2.2.6.1 cDNA第一条链的合成  42
        2.2.6.2 PCR扩增  42-44
  3 实验结果  44-62
    3.1 幼嫩花蕾总RNA、mRNA分离与纯化  44-45
    3.2 削减效率的检测  45-46
    3.3 抑制性消减杂交二次PCR结果  46-47
    3.4 正向消减产物的克隆  47-49
    3.5 斑点杂交结果  49
    3.6 序列测定和分析  49-59
    3.7 差异表达基因的进一步验证  59-60
    3.8 差异表达基因的功能分析  60-62
      3.8.1 钙离子结合蛋白  60
      3.8.2 剪接蛋白  60
      3.8.3 核转运蛋白  60-61
      3.8.4 肌动蛋白  61
      3.8.5 生物碱代谢:异胡豆苷合成酶  61-62
      3.8.6 极性细胞的形态发生  62
      3.8.7 其它  62
  4.讨论  62-63
  5.小结  63-64
  参考文献  64-68
第三章 甘蓝型油菜APETALA3重复基因cDNA的克隆、表达及功能分析  68-102
  1 引言  69-71
  2 材料与方法  71-81
    2.1 材料  71-74
      2.1.1 植物材料  71
      2.1.2 菌株和载体  71-73
      2.1.3 试剂和工具酶  73-74
    2.2 实验方法和步骤  74-81
      2.2.1 总RNA提取  74
      2.2.2 APETALA3基因编码区cDNA的克隆  74-75
        2.2.2.1 引物设计  74
        2.2.2.2 cDNA第一条链的合成  74-75
        2.2.2.3 PCR扩增  75
        2.2.2.4 JM109感受态细胞的制备  75
        2.2.2.5 PCR产物的纯化、连接和转化及重组子鉴定  75
      2.2.3 测序及序列分析  75
      2.2.4 Real-time PCR检测AP3基因的表达  75-77
        2.2.4.1 引物设计及特异性检测  75-76
        2.2.4.2 Real-time PCR  76-77
      2.2.5 酵母双杂交  77-81
        2.2.5.1 AP3基因特定片段的扩增  77-78
        2.2.5.2 pBD-AP3重组载体的构建  78
        2.2.5.3 酵母质粒的提取  78
        2.2.5.4 酵母菌AH109感受态细胞的制备  78-79
        2.2.5.6 共转化酵母感受态细胞  79
        2.2.5.7 半乳糖苷酶活性检测  79-81
  3 实验结果  81-93
    3.1 甘蓝型油菜AP3编码区的克隆与序列分析  81-85
      3.1.1 RT-PCR扩增及克隆  81
      3.1.2 序列测定与分析  81-85
    3.2 AP3的表达分析  85-91
      3.2.1 引物的可靠性  85-86
      3.2.2 Real-time定量PCR  86-91
        3.2.2.1 扩增效率和溶解曲线  86-89
        3.2.2.2 AP3基因的定量表达分析  89-91
    3.3 AP3和PI相互作用分析  91-93
  4 讨论  93-96
  5 小结  96-97
  参考文献  97-102
第四章 小核糖核蛋白BnSmD1正义、反义植物表达载体的构建及油菜的遗传转化  102-118
  1 引言  103-104
  2 材料与方法  104-108
    2.1 材料  104-105
      2.1.1 植物材料  104
      2.1.2 根瘤农杆菌及质粒  104
      2.1.3 主要试剂及培养基  104-105
    2.2 实验方法  105-108
      2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  105
      2.2.2 农杆菌EH105A感受态细胞的制备  105
      2.2.3 正反义植物表达载体的构建  105-107
      2.2.4 重组质粒转化农杆菌EH105A  107
      2.2.5 油菜外植体的获得  107
      2.2.6 农杆菌菌株及转化前处理  107
      2.2.7 农杆菌介导的油菜转化  107
      2.2.8 转基因油菜的PCR验证  107-108
  3 实验结果  108-114
    3.1 正义、反义片段的获得  108
    3.2 正义、反义重组载体的构建  108-109
    3.3 农杆菌的转化  109-110
    3.4 激素对油菜愈伤组织形成的影响  110-111
    3.5 激素对植株再生的影响  111-112
    3.6 除草剂Basta的选择剂量  112-113
    3.7 转基因苗的筛选与鉴定  113-114
  4 讨论  114-115
  5 小结  115-116
  参考文献  116-118
文献综述 高等植物花发育研究进展  118-142
  1 花的形态发生  118-119
  2 拟南芥成花转变的分子模式  119-124
    2.1 开花抑制途径  121
    2.2 光周期促进途径  121-123
    2.3 自主促进途径  123
    2.4 春化促进途径  123-124
  3 花分生组织及其特征基因  124-126
  4 控制开花时间基因与花分生组织特征基因的相互作用  126-127
  5 花器官发育的ABCDE模式与MADS-box基因  127-132
    5.1 花器官形态发生  127
    5.2 花器官发育的ABCDE模式  127-130
      5.2.1 A类基因  128-129
      5.2.2 B类基因  129
      5.2.3 C类基因  129-130
      5.2.4 D类基因  130
      5.2.5 E类基因  130
    5.3 MADS-box基因  130-132
  6 小结  132-133
  参考文献  133-142
在读博士期间论文发表情况  142-144
致谢  144

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 油菜籽（芸薹）
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